動物衣原體病(（Chlamydiosis）是由各類衣原體（Chlamydia）感染哺乳動物、禽類等動物所發(fā)生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。該病呈地方流行,常造成較大的危害及經(jīng)濟損失。目前針對的衣原體的檢測方法有細胞培養(yǎng)法、間接血凝試驗（1HA）、直接染色觀察等方法,但以上檢測方法對于快速準確的檢測衣原體尚存在較大的局限,如細胞培養(yǎng)法容易受到支原體的污染、靈敏度較低；間接血.凝試驗雖然操作比較簡單,但批次間差異較大、陽性檢出率較低；直接染色觀察靈敏度較低。因此,急需建立一種快速、簡捷、特異、靈敏、穩(wěn)定性好的檢測方法,用于衣原體的早期診斷、疫情監(jiān)控、流行病學調查等。為了保障畜牧業(yè)健康發(fā)展,加快現(xiàn)代畜牧業(yè)前進步伐,本研究以熒光定量PCR方法為技術基礎,建立了一種能單管同時鑒別三種動物衣原體的TaqMan-MGB探針多重熒光定量PCR方法,該方法特異、靈敏且穩(wěn)定性良好。主要研究內容包括以下幾方面：1、通過對GenBank中衣原體科的9種衣原體主要外膜蛋白序列進行比對分析,應用Primer Express3.0生物學軟件設計了3對特異的引物,3條探針和1對通用引物。采用通用引物進行PCR擴增... 

【文章來源】：西南大學重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻綜述
    1.1 衣原體科的簡介
        1.1.1 主要致病衣原體
        1.1.2 病原學
        1.1.3 衣原體的基因組學
        1.1.4 衣原體蛋白組學
    1.2 衣原體疫苗研究進展
        1.2.1 弱毒疫苗
        1.2.2 滅活疫苗
        1.2.3 核酸疫苗
    1.3 動物衣原體病的診斷學方法的研究進展
        1.3.1 直接染色觀察
        1.3.2 酶免檢測
        1.3.3 細胞培養(yǎng)的方法
        1.3.4 間接血凝試驗
        1.3.5 膠體金技術
        1.3.6 補體結合試驗
        1.3.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗
        1.3.8 藥敏試驗
        1.3.9 DNA芯片技術
    1.4 聚合酶鏈反應(PCR)的研究
    1.5 TaqMan—MGB探針的應用
第2章 引言
    2.1 研究目的及意義
    2.2 研究內容
        2.2.1 基因組序列的分析、引物與探針的設計
        2.2.2 建立三種衣原體的單重熒光定量PCR方法
        2.2.3 多重熒光定量PCR方法的建立
        2.2.4 所建立的多重熒光定量PCR方法與其它方法的比較
    2.3 多重熒光定量PCR方法的建立的技術路線
第3章 單重熒光定量PCR方法的優(yōu)化及建立
    3.1 材料
        3.1.1 標準菌株、細胞株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 試劑配制
    3.2 方法
        3.2.1 序列分析與引物設計
        3.2.2 衣原體DNA基因組的提取
        3.2.3 目的基因的擴增
        3.2.4 PCR產物回收純化
        3.2.5 目的片段的克隆
        3.2.6 單重熒光PCR反應條件的優(yōu)化
            3.2.6.1 單重突光定量PCR反應中探計濃度的優(yōu)化
            3.2.6.2 單重熒光PCR反應中引物濃度優(yōu)化
            3.2.6.3 單重焚光PCR反應體系中Tm值的優(yōu)化
        3.2.7 單重熒光定量PCR特異性的試驗
        3.2.8 單重熒光定量PCR靈敏度試驗
        3.2.9 單重熒光定量PCR標準曲線的構建
    3.3 結果與分析
        3.3.1 衣原體科已知序列的保守性和特異性
        3.3.2 衣原體核酸的擴增結果
        3.3.3 重組質粒的PCR鑒定結果
        3.3.4 重組質粒測序結果及序列分析
        3.3.5 三種重組陽性質粒OD值的測定結果
        3.3.6 單重熒光定量PCR反應條件優(yōu)化結果
            3.3.6.1 單重熒光定量PCR探針優(yōu)化的結果
            3.3.6.2 單重焚光定量PCR引物優(yōu)化的結果
            3.3.6.3 單重勞光定量PCR反應體系中Tm值優(yōu)化結果
        3.3.7 單重熒光定量PCR特異性的鑒定
        3.3.8 單重熒光定量PCR靈敏度試驗
        3.3.9 單重熒光定量PCR標準曲線的構建
    3.4 小結
第4章 多重熒光定量PCR方法的建立及應用
    4.1 材料
        4.1.1 實驗菌株
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
        4.1.4 試劑配制
    4.2 多重熒光定量PCR方法的建立
        4.2.1 多重熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化
        4.2.2 多重熒光定量PCR特異性的試驗
        4.2.3 多重熒光定量PCR靈敏度試驗
        4.2.4 多重熒光定量PCR穩(wěn)定性試驗
        4.2.5 多重熒光定量PCR標準曲線的構建
    4.3 結果
        4.3.1 多重熒光PCR反應中引物濃度的優(yōu)化的試驗結果
        4.3.2 多重熒光PCR反應探針濃度的優(yōu)化的試驗結果
        4.3.3 多重熒光PCR反應體系中Tm值的優(yōu)化
        4.3.4 多重熒光定量PCR特異性試驗結果
        4.3.5 多重熒光定量PCR方法靈敏度試驗結果
        4.3.6 多重熒光定量PCR穩(wěn)定性試驗結果
        4.3.7 標準曲線的構建試驗結果
    4.4 多重熒光定量PCR方法的應用
        4.4.1 臨床應用
        4.4.2 結果與分析
    4.5 小結
    4.6 討論
        4.6.1 三種衣原體單重熒光定量PCR方法的建立
        4.6.2 衣原體多重熒光定量PCR方法的建立
        4.6.3 衣原體多重熒光定量PCR方法的評價
        4.6.4 衣原體多重熒光定量PCR方法的臨床應用的評價
        4.6.5 后續(xù)工作建議及展望
參考文獻
縮略詞表
致謝
個人簡歷、在學校期間發(fā)表的學術論文及取得研究成果


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3211070