牛產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens,Cl.perfringens）引起的疾病以A型多發(fā)，被認(rèn)為是“牛猝死癥”（Sudden Death Syndrome，SDS）的主要病原。近年來(lái)多見(jiàn)D型菌導(dǎo)致牛腸毒血癥（Bovine enterotoxemia）的報(bào)道，因該病發(fā)病急、病程短、死亡率高，給我國(guó)畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。A型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要產(chǎn)生α毒素和ε毒素。研究表明這兩種毒素均為產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要免疫原，可刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性的保護(hù)性抗體。本研究擬通過(guò)大腸桿菌克隆并表達(dá)出具有一定生物學(xué)活性的α毒素蛋白、ε毒素蛋白以及α-ε融合蛋白。首先，PCR分別擴(kuò)增出A型產(chǎn)氣莢膜梭菌的α毒素基因和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的ε毒素基因，將兩基因分別插入到pET-28a質(zhì)粒中。與此同時(shí)，利用相同酶切位點(diǎn)連接的方法構(gòu)建含有α-ε融合基因的重組pET-28a質(zhì)粒。所有構(gòu)建好的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定正確后，分別轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）PlysS中，IPTG誘導(dǎo)，用SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)表達(dá)蛋白。采用鎳柱親和層析的方法純化蛋白，制備成疫苗進(jìn)行小鼠免... 

【文章來(lái)源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁(yè)數(shù)】：85 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

α毒素和ε毒素基因片段PCR產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果

.2 pMD18-T-α 和 pMD18-T-ε 質(zhì)粒的 PCR 和雙酶切鑒質(zhì)粒 M：DNA Marker 5 000；1：PCR 產(chǎn)物，925 bp；EcoRⅠ和 XolⅠ雙酶切產(chǎn)物粒 M：DNA Marker 5 000；1：陰性對(duì)照；2：SacⅠ和3：PCR 產(chǎn)物，981 bpfication of the recombinant pMD18-T-α and pMD18-T-ε pldouble endonucleases digested-T-α plasmid M: DNA Marker 5 000;1: Product of PCR prcontrol ;3: Product of EcoRⅠand XolⅠdouble endonucleaT-ε plasmid M: DNA Marker 5 000;1: Negative control ; 2 XolⅠdouble endonucleases digested;3: Product of PCR, 9ε 毒素基因的序列分析結(jié)果18-T-α 和 pMD18-T-ε 質(zhì)粒的 E.coli DH5α 甘油菌送上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用 DNAStar 軟件處理之后與 GeneBA B

質(zhì)粒pET28a-α的PCR及雙酶切鑒定結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]D型產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素研究進(jìn)展[J]. 高潔,張聰敏,劉偉,趙宇亮,趙寶華.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2013(10)
[3]不同動(dòng)物魏氏梭菌病的探討[J]. 王陽(yáng),管同恒,李超.  山東畜牧獸醫(yī). 2013(02)
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[5]產(chǎn)氣莢膜梭菌ε毒素基因的克隆、表達(dá)及其抗血清的制備[J]. 田冬青,彭小兵,蔣玉文,楊京嵐,陳小云,丁家波,屠偉英.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(03)
[6]魏氏梭菌引起牛猝死的診斷報(bào)告[J]. 孫力,周相華,宮汝娥,艾玉芹,李瑞紅.  中國(guó)奶牛. 2007(08)
[7]產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 趙立峰.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2007(S1)
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[9]C型產(chǎn)氣莢膜梭菌β1、β2毒素基因的融合[J]. 許崇波,曾瑾,許崇利,王玉炯.  微生物學(xué)報(bào). 2005(02)
[10]重組A型產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素保護(hù)性抗原的制備及初步免疫保護(hù)作用研究[J]. 林明輝,蔭俊,邢洪光,侯曉軍,王慧,宋偉.  生物工程學(xué)報(bào). 2004(01)

碩士論文
[1]產(chǎn)氣莢膜梭菌α和ε毒素蛋白高效表達(dá)體系的構(gòu)建及其免疫保護(hù)性的研究[D]. 盧田粉.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[2]分泌抗A型魏氏梭菌腸毒素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立和初步應(yīng)用[D]. 張紅英.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2004



本文編號(hào)：3210398