GLUT2是雞腸道主要的糖類轉(zhuǎn)運(yùn)載體,其表達(dá)直接影響著糖類物質(zhì)的吸收。而其生物學(xué)功能的實(shí)現(xiàn)受到了多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,如轉(zhuǎn)錄因子USF1、GATA2。但其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)尚不清楚。為了確定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),本試驗(yàn)選用一種新的技術(shù)手段CRISPR/Cas9來(lái)研究。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是基于細(xì)菌抵御外源核酸入侵的免疫防御機(jī)制改造而來(lái)的一種新興的基因編輯技術(shù)。它是一種依賴于RNA的,可定點(diǎn)編輯特定基因序列的方式。自2013年以來(lái),已成功應(yīng)用于多種動(dòng)植物及細(xì)胞中。目前CRISPR/Cas9技術(shù)在雞體內(nèi)的應(yīng)用尚少見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)的目的在于搭建雞細(xì)胞中的Cas9編輯平臺(tái),并以此為基礎(chǔ),初步探索其在雞體內(nèi)定點(diǎn)敲除中的應(yīng)用。細(xì)胞中的Cas9編輯平臺(tái)主要由三部分組成,分別為體外雞細(xì)胞的培養(yǎng),打靶載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染。本試驗(yàn)通過(guò)大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)上述三個(gè)步驟進(jìn)行摸索,初步建立了一套較為合適的實(shí)驗(yàn)條件。首先摸索建立了體外分離培養(yǎng)雞CEF的基本條件,分離培養(yǎng)、傳代、凍存復(fù)蘇及生長(zhǎng)狀況的測(cè)定,以及對(duì)不同制備方法的比較。然后對(duì)打靶載體構(gòu)建條件的摸索,以px458載體為基本骨架,針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的兩個(gè)預(yù)期結(jié)合位點(diǎn),構(gòu)建px... 

【文章來(lái)源】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西省

【文章頁(yè)數(shù)】：59 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
1.文獻(xiàn)綜述
    1.1 基因組編輯
        1.1.1 ZFNs技術(shù)
        1.1.2 TALEN技術(shù)
        1.1.3 CRISPR/Cas技術(shù)
            1.1.3.1 CRISPR/Cas技術(shù)簡(jiǎn)介
            1.1.3.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究歷史
            1.1.3.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)組成
            1.1.3.4 CRISPR/Cas的分類
            1.1.3.5 CRISPR/Cas Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型系統(tǒng)的作用機(jī)理
            1.1.3.6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用過(guò)程
            1.1.3.7 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用
            1.1.3.8 CRISPR/Cas系統(tǒng)的利弊
    1.2 雞體內(nèi)糖營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子
        1.2.1 糖類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT2
        1.2.2 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子
            1.2.2.1 轉(zhuǎn)錄因子GATA2
            1.2.2.2 轉(zhuǎn)錄因子USF1
    1.3 本研究的目的、內(nèi)容和意義
2.材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 試驗(yàn)儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試驗(yàn)試劑
        2.1.4 常用試劑的配制
        2.1.5 引物設(shè)計(jì)及其他分析軟件
        2.1.6 細(xì)胞系與質(zhì)粒
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 生物信息學(xué)分析
        2.2.2 構(gòu)建Cas9打靶載體
            2.2.2.1 設(shè)計(jì)識(shí)別靶點(diǎn)的sgRNA
            2.2.2.2 sgRNA兩條單鏈的合成
            2.2.2.3 兩條單鏈sgRNA退火成雙鏈及磷酸化處理
            2.2.2.4 雙鏈sRNA與px458載體連接
            2.2.2.5 px458-sgRNA重組質(zhì)粒的提取
        2.2.3 CEF細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            2.2.3.1 雞胚體的前處理
            2.2.3.2 組織塊培養(yǎng)法
            2.2.3.3 胰蛋白酶消化法
            2.2.3.4 雞小腸來(lái)源的成纖維細(xì)胞的制備
            2.2.3.5 次代CEF的制備
            2.2.3.6 CEF細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇
            2.2.3.7 雞CEF形態(tài)學(xué)性狀檢測(cè)
        2.2.4 測(cè)定基因GLUT2在原代CEF細(xì)胞中的初始表達(dá)量
            2.2.4.1 雞CEF細(xì)胞RNA的提取
            2.2.4.2 將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA
            2.2.4.3 測(cè)定cDNA的初始表達(dá)量
            2.2.4.4 表達(dá)量的數(shù)據(jù)處理
        2.2.5 px458-sgRNA(GLUT2)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞
3.試驗(yàn)結(jié)果
    3.1 生物信息學(xué)分析結(jié)果
    3.2 構(gòu)建px458-sgRNA(GLUT2)打靶載體
        3.2.1 sgRNA雙鏈的形成
        3.2.2 線性化原載體px458
        3.2.3 PCR鑒別陽(yáng)性重載體
        3.2.4 DNA測(cè)序鑒定px458-GLUT2打靶載體
    3.3 分離培養(yǎng)原代雞CEF
        3.3.1 組織塊培養(yǎng)法
        3.3.2 胰蛋白酶消化法
        3.3.3 不同來(lái)源雞胚培養(yǎng)的原代CEF的形態(tài)觀察
        3.3.4 次代CEF細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
        3.3.5 原代、次代CEF細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        3.3.6 成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定
    3.4 測(cè)定基因GLUT2在原代CEF細(xì)胞中的初始表達(dá)量
        3.4.1 RNA提取結(jié)果
        3.4.2 GLUT2基因在CEF中的表達(dá)量
    3.5 px458-sgRNA(GLUT2)打靶載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞
4.討論
    4.1 Cas9靶點(diǎn)選取
    4.2 影響體外分離培養(yǎng)CEF的主要因素
5.結(jié)論
參考文獻(xiàn)
Abstract
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]紫杉醇緩釋劑型對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用[J]. 孔穎穎,張杰,王婷,趙志剛,李新剛,邱小建,王玉玲.  臨床肺科雜志. 2014(10)
[2]雞胚三類組織體外培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性分析[J]. 邰大鵬,劉坤,特日格樂(lè),侯東霞,李瑤,李煜.  中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào). 2011(09)
[3]CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌和噬菌體的共進(jìn)化[J]. 李鐵民,杜波.  遺傳. 2011(03)
[4]利用不同方法培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞的研究[J]. 劉洪斌,孫心,鄭桂軍.  中國(guó)獸藥雜志. 2009(12)
[5]哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植研究進(jìn)展[J]. 于洋,王柳,周琪.  生命科學(xué). 2009(05)
[6]水稻W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因功能研究進(jìn)展[J]. 宋鈺,荊邵娟,余迪求.  中國(guó)水稻科學(xué). 2009(05)

碩士論文
[1]大骨雞、青殼蛋雞成纖維細(xì)胞庫(kù)的建立及生物學(xué)特性研究[D]. 躍華.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2006
[2]牛成纖維細(xì)胞庫(kù)的建立及生物學(xué)特性研究[D]. 郭瑜.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005



本文編號(hào)：3205853