布拉氏酵母菌是一種從印尼荔枝等水果中分離到的非致病性益生酵母菌，具有抗菌、抗毒、止瀉、維持宿主胃腸道微生態(tài)平衡、提高機體非特異性免疫力等益生性。目前，布拉氏酵母菌的研究主要集中在臨床應用方面，而針對其作用機制，特別是在分子水平上的作用機制，以及遺傳改造等卻少有研究和報導。自Smith提出表面展示技術以來，表面展示技術得到了快速發(fā)展。對于真核生物蛋白來說，酵母表面展示系統(tǒng)無疑是比較理想的表面展示系統(tǒng)。利用益生菌表面展示系統(tǒng)研究活載體疫苗是醫(yī)學以及獸醫(yī)學領域中重要的應用之一，人們已經(jīng)利用釀酒酵母和乳酸桿菌作為平臺研究活載體疫苗，而布拉氏酵母菌作為最有價值的益生菌之一，其表面展示系統(tǒng)在國內(nèi)外尚未有報導。本研究利用a-凝集素成功地構(gòu)建了兩種布拉氏酵母菌表面展示系統(tǒng)：瞬時表達表面展示系統(tǒng)和穩(wěn)定表達表面展示系統(tǒng)。這是第一次將表面展示技術用于布拉氏酵母菌中，拓寬了布拉氏酵母菌的應用領域。本研究主要做了以下三方面的工作：（一）瞬時表達表面展示系統(tǒng)：1.瞬時表達表面展示質(zhì)粒的構(gòu)建：將AGA1基因（SbAGA1）以及AGA2表達盒克隆到基礎質(zhì)粒pSP-G1上，使SbAGA1在持續(xù)表達啟動子pTEF1的控制... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 布拉氏酵母菌
        1.1.1 布拉氏酵母菌的生物學特性
        1.1.2 益生性以及作用機制
        1.1.3 應用
    1.2 微生物表面展示
        1.2.1 噬菌體表面展示技術
        1.2.2 細菌表面展示系統(tǒng)
        1.2.3 酵母表面展示系統(tǒng)
        1.2.4 應用
    1.3 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株以及質(zhì)粒載體
        2.1.2 試劑
        2.1.3 主要設備
    2.2 方法
        2.2.1 試驗所用溶液的配制
        2.2.2 目的基因的獲取
        2.2.3 瞬時表達表面展示質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.4 構(gòu)建 EGFP 瞬時表達表面展示質(zhì)粒
        2.2.5 構(gòu)建 EtMic2 瞬時表達表面展示質(zhì)粒
        2.2.6 穩(wěn)定表達表面展示質(zhì)粒 pLSDSb 和 pLSDSb2 的構(gòu)建
        2.2.7 構(gòu)建 EGFP 穩(wěn)定表達表面展示質(zhì)粒
        2.2.8 SbAGA1、SbAGA2 基因序列測序與分析
        2.2.9 酵母轉(zhuǎn)染
        2.2.10 陽性重組子的篩選
        2.2.11 陽性重組子的培養(yǎng)
        2.2.12 間接免疫熒光
        2.2.13 流式細胞儀分析
        2.2.14 Western blot
3 結(jié)果與分析
    3.1 序列分析結(jié)果
        3.1.1 SbAGA1 基因序列分析結(jié)果
        3.1.2 SbAGA2 基因序列分析結(jié)果
    3.2 瞬時表達表面展示系統(tǒng)展示 EGFP
        3.2.1 瞬時表達表面展示質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
        3.2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
        3.2.3 EGFP 在酵母細胞表面展示結(jié)果
        3.2.4 Western blot 結(jié)果
    3.3 穩(wěn)定表達表面展示系統(tǒng)展示 EGFP
        3.3.1 穩(wěn)定表達表面展示質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果
        3.3.2 pLSDSb-GFP 和 pLSDSb2-GFP 質(zhì)粒鑒定結(jié)果
        3.3.3 EGFP 表面展示結(jié)果
    3.4 布拉氏酵母菌表面展示系統(tǒng)的應用研究
        3.4.1 pSDSb-MIC2 和 pSDSb2-MIC2 質(zhì)粒鑒定結(jié)果
        3.4.2 EtMic2 在酵母細胞表面展示結(jié)果
        3.4.3 V5 標簽的染色結(jié)果
        3.4.4 Western blot 結(jié)果
4 討論
5 結(jié)論
6 參考文獻
7 致謝
8 碩士期間發(fā)表的論文



本文編號：3198771