本文關(guān)鍵詞：miR-181a-5p和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對成肌分化的調(diào)控作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：成肌分化過程涉及多種生物學(xué)通路,大量的研究表明miRNAs和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在成肌分化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。研究顯示miR-181a-5p能夠靶向結(jié)合Hox-A11,上調(diào)成肌分化關(guān)鍵基因MyoD, MyoG的表達(dá)量,促進(jìn)成肌分化。此外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS)能夠通過ERS介導(dǎo)的凋亡途徑促進(jìn)分化過程中分化能力較弱的細(xì)胞凋亡,提高分化效率。因而我們推測：niR-181a-5p和ERS在成肌分化過程中可能存在協(xié)同效應(yīng),共同促進(jìn)成肌分化,但需要進(jìn)一步的實驗驗證。本研究分析了C2C12細(xì)胞分化過程中miR-181a-5p的表達(dá)趨勢,通過轉(zhuǎn)染miRNA mimics和inhibitor,實現(xiàn)過表達(dá)和干擾miRNA,探究了miR-181a-5p對C2C12細(xì)胞增殖、分化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和肌纖維類型的影響。用毒胡蘿卜素(Thapsigargin, Tg)處理C2C12細(xì)胞,使細(xì)胞發(fā)生ERS,探究了ERS對C2C12細(xì)胞內(nèi)源性miR-181a-5p和成肌分化的影響。最后對Tg預(yù)處理的C2C 12細(xì)胞和豬肌肉成纖維細(xì)胞(Porcine Muscle Fibroblasts, PMFs)過表達(dá)和干擾miR-181a-5p,分析了ERS情況下,miR-181a-5p對C2C12細(xì)胞和PMFs凋亡的影響,并利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證了豬上GRP78和ssc-miR-181a-5p的靶標(biāo)關(guān)系。主要結(jié)果如下(1) miR-181a-5p的種子序列及其在GRP78上的結(jié)合序列在不同物種中序列高度保守,熒光定量PCR (RT-qPCR)結(jié)果顯示miR-181a-5p在C2C12細(xì)胞分化過程中的表達(dá)量呈上升趨勢。(2) RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-181a-5p促進(jìn)C2C12細(xì)胞分化,靶基因GRP78的mRNA表達(dá)量有所降低,但未達(dá)到顯著水平(P0.05),成肌分化相關(guān)基因Myod, MyoG, Myf5, Myf6和ERS介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)基因ATF6, Casp12, CHOP, EIF-2α的mRNA表達(dá)量顯著升高(P0.01或P0.05)；干擾miR-181a-5p抑制C2C12細(xì)胞分化,靶基因GRP78的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P0.01),成肌分化相關(guān)基因Myod, MyoG, Myf5, Myf6和ERS介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)基因ATF6, Casp12, CHOP EIF-α的mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.01或P0.05)。凋亡抑制基因BCL2的mRNA表達(dá)量在過表達(dá)和干擾miR-181a-5p時均顯著降低(P0.01或P0.05)。(3)過表達(dá)miR-181a-5p顯著增加了MyHc Ⅱa的mRNA表達(dá)量(P0.01),顯著降低了MyHc Ⅰ的mRNA表達(dá)量(P0.05),使肌纖維中Ⅱ型肌纖維的含量升高；抑制miR-181a-5p顯著降低了MyHcⅡα的mRNA表達(dá)量(P0.01),從而增加了Ⅰ型肌纖維的含量。(4)過表達(dá)或抑制miR-181a-5p后,利用CCK-8細(xì)胞增殖和毒性檢測試劑分析miR-181a-5p對C2C12細(xì)胞增殖的影響,與對照組相比,過表達(dá)和抑制miR-181a-5p對C2C12細(xì)胞增殖影響均不顯著(P0.05)。(5)用0.1μM Tg處理C2C12細(xì)胞,24 h時RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn),Tg處理顯著增加了ERS介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)基因ATF6,Casp12,CHOP,EIF-2α和GRP78的mRNA表達(dá)量(P0.01),成功誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生ERS。同時,Tg處理后,C2C12細(xì)胞中miR-181a-5p和成肌分化相關(guān)基因Myf5,Myf6和MyoD的mRNA表達(dá)量顯著升高(P0.01)。(6)用0.1 μM Tg處理C2C12細(xì)胞,向細(xì)胞中過表達(dá) miR-181a-5p,24 h時Hoechst染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核碎片增加,CCK-8分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性顯著降低(P0.01),RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)ERS介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)基因ATF6,Casp12,CHOP,EIF-2α的mRNA表達(dá)量顯著升高(P0.01),靶基因GRP78和抗凋亡基因BCL2的表達(dá)量顯著降低(P0.01)；抑制miR-181a-5p,細(xì)胞核碎片,細(xì)胞活性以及基因表達(dá)量實驗結(jié)果與過表達(dá)miR-181a-5p相反。(7)成功構(gòu)建豬GRP78基因的雙熒光素酶報告質(zhì)粒,利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)豬GRP78和ssc-miR-181a-5p存在靶標(biāo)關(guān)系,且靶基因的mRNA水平不受調(diào)控(P0.05),初步揭示ssc-miR-181a-5p可能在蛋白水平抑制靶基因的表達(dá)。(8)體外分離培養(yǎng)PMFs,0.1μM Tg處理PMFs細(xì)胞,向細(xì)胞中過表達(dá)ssc-miR-181a-5p,24 h時候發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核碎片增加,細(xì)胞活性顯著降低(P0.01),靶基因GRP78的mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.01),ERS介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)基因ATF6,EIF-2α的mRNA表達(dá)量顯著升高(P0.01)；抑制ssc-181a-5p細(xì)胞核碎片,細(xì)胞活性以及基因表達(dá)量與過表達(dá)ssc-miR-181a-5p實驗結(jié)果相反。
【關(guān)鍵詞】：miR-181a-5p 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 成肌分化 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 符號說明10-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-22
• 1.1 骨骼肌形成概述13-14
• 1.1.1 骨骼肌的生長發(fā)育過程13
• 1.1.2 骨骼肌纖維分類13-14
• 1.1.3 參與骨骼肌生長發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子14
• 1.2 miRNA簡述14-18
• 1.2.1 miRNA的形成及調(diào)控機(jī)制15
• 1.2.2 miRNA的鑒定及檢測方法15-16
• l 2.3 miRNA的靶基因預(yù)測及驗證方法16-17
• 1.2.4 miR-181a-5p研究現(xiàn)狀17-18
• 1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激18-19
• 1.3.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要的生物學(xué)通路18
• 1.3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肌肉生長過程中的作用研究18-19
• 1.4 miRNAs和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激19-22
• 1.4.1 miRNAs是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)器19-20
• 1.4.2 miRNAs是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的效應(yīng)器20-22
• 1.5 本研究的目的和意義22
• 2 材料與方法22-36
• 2.1 實驗材料22-28
• 2.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞22-23
• 2.1.2 主要試劑23-25
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.1.4 常用試劑配制26-28
• 2.1.5 主要分子生物學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫28
• 2.2 實驗方法28-36
• 2.2.1 組織DNA提取28-29
• 2.2.2 細(xì)胞總RNA提取29
• 2.2.3 mRNA反轉(zhuǎn)錄29-30
• 2.2.4 miRNA反轉(zhuǎn)錄30
• 2.2.5 RT-qPCR30-31
• 2.2.6 豬GRP783’-UTR擴(kuò)增及雙熒光素酶載體構(gòu)建31-33
• 2.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染33-35
• 2.2.8 細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性檢測35
• 2.2.9 C2C12細(xì)胞HE染色35-36
• 2.2.10 C2C12細(xì)胞和PMFs Hoechst 33342染色36
• 2.2.11 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激36
• 2.2.12 數(shù)據(jù)分析36
• 3 結(jié)果與分析36-49
• 3.1 C2C12細(xì)胞分化模型建立36-37
• 3.2 進(jìn)化保守性分析以及成肌分化過程中miR-181a-5p的表達(dá)譜37-38
• 3.3 miR-181a-5p對ERS介導(dǎo)的凋亡信號通路和成肌分化的影響38-41
• 3.3.1 轉(zhuǎn)染效率檢測38-39
• 3.3.2 過表達(dá)miR-181a-5p激活ERS介導(dǎo)的凋亡途徑并促進(jìn)成肌分化39
• 3.3.3 抑制miR-181a-5p緩和ERS介導(dǎo)的凋亡途徑并抑制成肌分化39-41
• 3.4 miR-181a-5p對肌纖維類型組成的影響41-42
• 3.5 miR-181a-5p對C2C12細(xì)胞增殖的影響42-43
• 3.6 ERS對成肌分化和miR-181a-5p表達(dá)量的影響43-44
• 3.7 miR-181a-5p調(diào)控ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路44-49
• 3.7.1 miR-181a-5p通過ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路促進(jìn)C2C12細(xì)胞凋亡44-46
• 3.7.2 miR-181a-5p通過ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路促進(jìn)PMFs細(xì)胞凋亡46-49
• 4 討論49-52
• 4.1 miR-181a-5p在成肌分化過程中的調(diào)控作用49-50
• 4.2 ERS在成肌分化過程中的調(diào)控作用50
• 4.3 miR-181a-5p調(diào)控ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號通路50-52
• 5 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 致謝59-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄60

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