豬繁殖與呼吸綜合癥病病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬鏈球菌2型（SS2）這三種病原體每年均能給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成難以估量的經(jīng)濟(jì)損失。由于這三種病原體均能引起感染豬的呼吸道癥狀，且臨床發(fā)病癥狀極為相似，難以通過臨床診斷進(jìn)行確診。因此，對(duì)這三種病原體引起的疾病進(jìn)行早期鑒別診斷，進(jìn)而指導(dǎo)養(yǎng)殖戶采取有效的控制措施顯得尤為重要。本試驗(yàn)根據(jù)Gene Bank中發(fā)布的PRRSV的nsp2基因、PCV2的全基因和SS2的16s rRNA基因序列，分別找出其保守區(qū)并設(shè)計(jì)了三對(duì)特異性引物。建立并分別進(jìn)行了優(yōu)化檢測PRRSV、PCV2和SS2三種病原體的單重PCR方法和多重PCR方法。三種病原體的單重PCR檢測方法的反應(yīng)條件中退火溫度均確定為51.9℃，循環(huán)數(shù)的結(jié)果選定為35個(gè)循環(huán)；其中PCV2和SS2的單重PCR反應(yīng)體系中（25μL體系）dNTP（2.5mM）加入量均確定為3μL，引物（10μmol/L）加入量均確定為0.7μL；PRRSV的單重PCR反應(yīng)體系中（50μL體系）Mg2+（25mM）加入量確定為8μL，dNTP（10mM）加入量確定為5μL，引物（10μmol/L）加入量均確定為... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
目錄
1 引言
    1.1 豬繁殖與呼吸綜合征研究進(jìn)展
        1.1.1 病原分子生物學(xué)特性
        1.1.2 流行病學(xué)及病理變化
        1.1.3 檢測技術(shù)研究進(jìn)展
    1.2 豬圓環(huán)病毒感染研究進(jìn)展
        1.2.1 病原分子生物學(xué)特性
        1.2.2 流行病學(xué)及病理變化
        1.2.3 檢測技術(shù)研究進(jìn)展
    1.3 豬鏈球菌病研究進(jìn)展
        1.3.1 病原分子生物學(xué)特性
        1.3.2 流行病學(xué)及病理變化
        1.3.3 檢測技術(shù)研究進(jìn)展
    1.4 研究的目的及意義
2 多重 PCR 方法的建立及初步應(yīng)用
    2.1 材料
        2.1.1 參考毒株
        2.1.2 病料采集
        2.1.3 主要試劑及配制
        2.1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.1.5 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)
        2.2.2 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
        2.2.3 病毒的增殖
        2.2.4 病原體RNA、DNA的提取
        2.2.5 單重PCR檢測方法的建立
        2.2.6 PCR產(chǎn)物純化與回收
        2.2.7 目的基因與pMD19-T載體連接
        2.2.8 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備-CaCl_2法
        2.2.9 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.2.10 重組質(zhì)粒的提取
        2.2.11 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
        2.2.12 序列測定
        2.2.13 單重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.2.14 多重PCR檢測方法的建立
        2.2.15 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.2.16 多重PCR特異性試驗(yàn)
        2.2.17 單重PCR和多重PCR敏感性試驗(yàn)
        2.2.18 重復(fù)性試驗(yàn)
        2.2.19 單重PCR與多重PCR陽性符合率檢測
        2.2.20 臨床樣品檢測
3 結(jié)果
    3.1 單重 PCR 方法建立的結(jié)果
    3.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果
    3.3 序列測定及分析
    3.4 單重 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果
        3.4.1 單重PCR方法退火溫度優(yōu)化結(jié)果
        3.4.2 單重PCR反應(yīng)dNTP優(yōu)化結(jié)果
        3.4.3 單重PCR反應(yīng)引物優(yōu)化結(jié)果
        3.4.4 單重 PCR 反應(yīng) Mg_2+優(yōu)化結(jié)果
        3.4.5 單重PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果
    3.5 多重 PCR 方法的建立結(jié)果
    3.6 多重 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果
        3.6.1 多重PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化結(jié)果
        3.6.2 多重 PCR 反應(yīng) Mg2_+優(yōu)化結(jié)果
        3.6.3 多重PCR反應(yīng)dNTP優(yōu)化結(jié)果
        3.6.4 多重PCR反應(yīng)引物優(yōu)化結(jié)果
        3.6.5 多重PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)優(yōu)化結(jié)果
    3.7 多重 PCR 反應(yīng)特異性試驗(yàn)結(jié)果
    3.8 單重 PCR 和多重 PCR 反應(yīng)敏感性試驗(yàn)結(jié)果
    3.9 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
    3.10 單重 PCR 與多重 PCR 陽性符合率檢測結(jié)果
    3.11 臨床樣品檢測結(jié)果
4 討論
    4.1 單重 PCR 檢測方法的建立
    4.2 多重 PCR 檢測方法的建立
    4.3 應(yīng)用多重 PCR 方法對(duì)臨床樣品的檢測
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡歷
致謝



本文編號(hào)：3187288