H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）危害嚴(yán)重,不僅能引起家禽的大量死亡,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,而且還常常引起人發(fā)病,嚴(yán)重者可至人死亡。研究流感病毒與宿主相互作用關(guān)系,對(duì)于闡釋流感病毒的致病機(jī)理至關(guān)重要。前期以實(shí)驗(yàn)室分離到的一株H5N1高致病性禽流感病毒感染A549細(xì)胞,利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,鑒定了一些差異表達(dá)的宿主蛋白,其中PHB蛋白表達(dá)水平在病毒感染宿主細(xì)胞后明顯上調(diào)。因此,本研究進(jìn)一步對(duì)其功能進(jìn)行研究。主要研究成果如下:1.利用Real-time RT-PCR和western blot的方法檢測(cè)A549細(xì)胞感染HPAIV后,PHB在不同時(shí)間點(diǎn)mRNA和蛋白水平的上調(diào)表達(dá)。2.構(gòu)建了 PHB的真核表達(dá)質(zhì)粒,通過Real-time RT-PCR和western blot驗(yàn)證其表達(dá)效果良好。在轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后,用H5N1禽流感病毒感染細(xì)胞,利用Real-time RT-PCR、western blot、間接免疫熒光的方法證明在H5N1禽流感病毒感染A549細(xì)胞后,PHB促進(jìn)病毒蛋白NP的合成。通過病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)證明在H5N1禽流感病毒感染A549細(xì)胞后,PHB增加上清中的病毒滴度。均證明... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表(Abbreviation)
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 流感病毒簡(jiǎn)介
    1.2 流感病毒與細(xì)胞凋亡
        1.2.1 細(xì)胞凋亡
        1.2.2 流感病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
    1.3 流感病毒與Ⅰ型干擾素
        1.3.1 Ⅰ型干擾素(IFNα/β)的產(chǎn)生與應(yīng)答
        1.3.2 Ⅰ型干擾素(IFNα/β)的抗流感病毒作用
        1.3.3 流感病毒對(duì)干擾素的抑制作用
    1.4 PHB家族簡(jiǎn)介
        1.4.1 PHB家族的組成
        1.4.2 PHB家族蛋白結(jié)構(gòu)
        1.4.3 PHB復(fù)合物定位
        1.4.4 PHB維持線粒體的發(fā)育與功能
        1.4.5 PHB調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡
        1.4.6 PHB與E2F/Rb
        1.4.7 PHB與p53
        1.4.8 參與IL6 JAK-STAT通路
        1.4.9 參與Raf-MEK-ERK通路
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 質(zhì)粒、菌株和病毒
        3.1.2 細(xì)胞培養(yǎng),轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
        3.1.3 細(xì)菌培養(yǎng)基及抗生素的配制
        3.1.4 主要酶和試劑盒
        3.1.5 RNA抽提及熒光定量試劑
        3.1.6 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western Blot相關(guān)試劑
        3.1.7 抗體
        3.1.8 主要分子生物學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫
        3.1.9 主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 PCR的擴(kuò)增、產(chǎn)物的純化回收、載體連接及測(cè)序
        3.2.2 去內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取
        3.2.3 病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)
        3.2.4 人肺泡上皮細(xì)胞(A549)的培養(yǎng)
        3.2.5 A549細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        3.2.7 293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
        3.2.8 細(xì)胞總RNA的提取及DNase處理
        3.2.9 總RNA的反轉(zhuǎn)錄
        3.2.10 SYBR green Real-time RT-PCR
        3.2.11 Real-time RT-PCR數(shù)據(jù)分析
        3.2.12 Western blot蛋白樣品的制備
        3.2.13 考馬斯亮藍(lán)G250染色液蛋白定量法
        3.2.14 Western blot
        3.2.15 間接免疫熒光
        3.2.16 雙熒光素酶活性檢測(cè)
        3.2.17 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
4 結(jié)果與分析
    4.1 H5N1禽流感DW毒株病毒滴度的測(cè)定
    4.2 H5N1禽流感病毒感染A549細(xì)胞對(duì)PHB mRNA水平的影響
    4.3 H5N1禽流感病毒感染A549細(xì)胞對(duì)PHB蛋白水平的影響
    4.4 PHB對(duì)H5N1禽流感病毒增殖的影響
        4.4.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-PHB的構(gòu)建及表達(dá)效果驗(yàn)證
        4.4.2 PHB促進(jìn)A549細(xì)胞內(nèi)病毒蛋白的合成
        4.4.3 病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上清中的病毒滴度
    4.5 PHB亞細(xì)胞定位研究
    4.6 PHB對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響
    4.7 PHB對(duì)Ⅰ型干擾素應(yīng)答通路的影響
        4.7.1 pCMV-PHB在293T細(xì)胞上的表達(dá)效果驗(yàn)證
        4.7.2 雙熒光素酶檢測(cè)PHB對(duì)IFNβ啟動(dòng)子活性的影響
        4.7.3 雙熒光素酶檢測(cè)PHB對(duì)ISRE啟動(dòng)子活性的影響
        4.7.4 Real -time RT-PCR檢測(cè)PHB對(duì)ISGs表達(dá)的影響
        4.7.5 PHB抑制STAT1和STAT2的表達(dá)
5 討論
    5.1 H5N1禽流感病毒感染對(duì)PHB表達(dá)的影響
    5.2 PHB對(duì)H5N1禽流感病毒增殖的影響
    5.3 PHB亞細(xì)胞定位研究
    5.4 PHB對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響
    5.5 PHB對(duì)Ⅰ型干擾素應(yīng)答通路的影響
6 小結(jié)
    6.1 主要結(jié)論
    6.2 值得進(jìn)一步探索的問題
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3182664