H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）危害嚴(yán)重,不僅能引起家禽的大量死亡,造成巨大經(jīng)濟損失,而且還常常引起人發(fā)病,嚴(yán)重者可至人死亡。研究流感病毒與宿主相互作用關(guān)系,對于闡釋流感病毒的致病機理至關(guān)重要。前期以實驗室分離到的一株H5N1高致病性禽流感病毒感染A549細胞,利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,鑒定了一些差異表達的宿主蛋白,其中PHB蛋白表達水平在病毒感染宿主細胞后明顯上調(diào)。因此,本研究進一步對其功能進行研究。主要研究成果如下:1.利用Real-time RT-PCR和western blot的方法檢測A549細胞感染HPAIV后,PHB在不同時間點mRNA和蛋白水平的上調(diào)表達。2.構(gòu)建了 PHB的真核表達質(zhì)粒,通過Real-time RT-PCR和western blot驗證其表達效果良好。在轉(zhuǎn)染A549細胞后,用H5N1禽流感病毒感染細胞,利用Real-time RT-PCR、western blot、間接免疫熒光的方法證明在H5N1禽流感病毒感染A549細胞后,PHB促進病毒蛋白NP的合成。通過病毒蝕斑實驗證明在H5N1禽流感病毒感染A549細胞后,PHB增加上清中的病毒滴度。均證明... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表(Abbreviation)
1 文獻綜述
    1.1 流感病毒簡介
    1.2 流感病毒與細胞凋亡
        1.2.1 細胞凋亡
        1.2.2 流感病毒誘導(dǎo)細胞凋亡
    1.3 流感病毒與Ⅰ型干擾素
        1.3.1 Ⅰ型干擾素(IFNα/β)的產(chǎn)生與應(yīng)答
        1.3.2 Ⅰ型干擾素(IFNα/β)的抗流感病毒作用
        1.3.3 流感病毒對干擾素的抑制作用
    1.4 PHB家族簡介
        1.4.1 PHB家族的組成
        1.4.2 PHB家族蛋白結(jié)構(gòu)
        1.4.3 PHB復(fù)合物定位
        1.4.4 PHB維持線粒體的發(fā)育與功能
        1.4.5 PHB調(diào)節(jié)細胞凋亡
        1.4.6 PHB與E2F/Rb
        1.4.7 PHB與p53
        1.4.8 參與IL6 JAK-STAT通路
        1.4.9 參與Raf-MEK-ERK通路
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 質(zhì)粒、菌株和病毒
        3.1.2 細胞培養(yǎng),轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑
        3.1.3 細菌培養(yǎng)基及抗生素的配制
        3.1.4 主要酶和試劑盒
        3.1.5 RNA抽提及熒光定量試劑
        3.1.6 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western Blot相關(guān)試劑
        3.1.7 抗體
        3.1.8 主要分子生物學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫
        3.1.9 主要實驗儀器及設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 PCR的擴增、產(chǎn)物的純化回收、載體連接及測序
        3.2.2 去內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取
        3.2.3 病毒蝕斑實驗
        3.2.4 人肺泡上皮細胞(A549)的培養(yǎng)
        3.2.5 A549細胞的感染實驗
        3.2.6 A549細胞的轉(zhuǎn)染
        3.2.7 293T細胞的轉(zhuǎn)染
        3.2.8 細胞總RNA的提取及DNase處理
        3.2.9 總RNA的反轉(zhuǎn)錄
        3.2.10 SYBR green Real-time RT-PCR
        3.2.11 Real-time RT-PCR數(shù)據(jù)分析
        3.2.12 Western blot蛋白樣品的制備
        3.2.13 考馬斯亮藍G250染色液蛋白定量法
        3.2.14 Western blot
        3.2.15 間接免疫熒光
        3.2.16 雙熒光素酶活性檢測
        3.2.17 統(tǒng)計學(xué)方法
4 結(jié)果與分析
    4.1 H5N1禽流感DW毒株病毒滴度的測定
    4.2 H5N1禽流感病毒感染A549細胞對PHB mRNA水平的影響
    4.3 H5N1禽流感病毒感染A549細胞對PHB蛋白水平的影響
    4.4 PHB對H5N1禽流感病毒增殖的影響
        4.4.1 真核表達質(zhì)粒pCMV-PHB的構(gòu)建及表達效果驗證
        4.4.2 PHB促進A549細胞內(nèi)病毒蛋白的合成
        4.4.3 病毒蝕斑實驗檢測上清中的病毒滴度
    4.5 PHB亞細胞定位研究
    4.6 PHB對A549細胞凋亡的影響
    4.7 PHB對Ⅰ型干擾素應(yīng)答通路的影響
        4.7.1 pCMV-PHB在293T細胞上的表達效果驗證
        4.7.2 雙熒光素酶檢測PHB對IFNβ啟動子活性的影響
        4.7.3 雙熒光素酶檢測PHB對ISRE啟動子活性的影響
        4.7.4 Real -time RT-PCR檢測PHB對ISGs表達的影響
        4.7.5 PHB抑制STAT1和STAT2的表達
5 討論
    5.1 H5N1禽流感病毒感染對PHB表達的影響
    5.2 PHB對H5N1禽流感病毒增殖的影響
    5.3 PHB亞細胞定位研究
    5.4 PHB對A549細胞凋亡的影響
    5.5 PHB對Ⅰ型干擾素應(yīng)答通路的影響
6 小結(jié)
    6.1 主要結(jié)論
    6.2 值得進一步探索的問題
參考文獻
致謝



本文編號：3182664