Hc38基因位于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲腸上皮微絨毛上，澳大利亞學(xué)者Hartman等（2001）在通過Northern雜交發(fā)現(xiàn)該基因在腸上皮微絨毛內(nèi)呈高豐度表達(dá)，進(jìn)而推測其表達(dá)產(chǎn)物是一種與吸血和免疫逃避有關(guān)的功能蛋白，為防治捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病提供可靠的方法。本論文取得的主要研究結(jié)果如下：采用PCR方法從Hc38全長質(zhì)粒中擴(kuò)增出保守結(jié)構(gòu)域HcP，并構(gòu)建真核表達(dá)載體pPIC9K-HcP,電轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中,采用G418抗性梯度法篩選得到多拷貝重組菌株，甲醇誘導(dǎo)表達(dá),應(yīng)用SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況,并將表達(dá)蛋白用免疫親和層析柱純化，將純化后的表達(dá)產(chǎn)物對牛、羊、雞、兔、鼠的紅細(xì)胞進(jìn)行凝集試驗，檢測其凝集活性；對天然宿主羊的IgG、血紅蛋白在體外進(jìn)行孵育，應(yīng)用SDS-PAGE檢測降解情況。實驗結(jié)果表明重組的GS115酵母菌株可表達(dá)分泌pHcP,其表達(dá)在96h達(dá)高峰,分泌量可達(dá)0.1mg/L，且純化后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Westernblot分析，能產(chǎn)生特異的免疫印跡條帶，說明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性。HcP表達(dá)產(chǎn)物對動物紅細(xì)胞的凝集活性具有種屬專一性；對天然宿主羊的IgG、血紅蛋白都有降解... 

【文章來源】：石河子大學(xué)新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
主要英文縮寫對照
第一章 文獻(xiàn)綜述
    綜述一 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲及Hc38基因研究進(jìn)展
        1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲概述
            1.1 病原學(xué)
            1.2 生活史
            1.3 流行病學(xué)
            1.4 臨床癥狀和病理變化
            1.5 診斷
            1.6 預(yù)防
        2 Hc38基因研究進(jìn)展
    綜述二 畢赤酵母表達(dá)外源基因的研究進(jìn)展
        1 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點
        2 畢赤酵母的生物學(xué)特性
        3 畢赤酵母表達(dá)載體及元件
            3.1 表達(dá)載體
            3.2 啟動子
            3.3 信號肽序列
            3.4 選擇標(biāo)記
        4 畢赤酵母的宿主菌
        5 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及重組整合
            5.1 質(zhì)粒在AOXI或aoxl::ARG4位點的插入[59]
            5.2 質(zhì)粒在his4位點的插入
            5.3 質(zhì)粒在AOXl位點的置換
        6 影響畢赤酵母表達(dá)外源基因的因素
            6.1 外源基因自身特性
            6.2 培養(yǎng)條件的影響
            6.3 載體菌株
            6.4 產(chǎn)物穩(wěn)定性
第二章 實驗部分
    實驗一 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Hc38基因保守結(jié)構(gòu)域在畢赤酵母中的表達(dá)
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
            1.3 電轉(zhuǎn)化及重組酵母的篩選鑒定
            1.4 重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)
            1.5 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析[83]
            1.6 HcP表達(dá)產(chǎn)物的純化[84]
            1.7 純化產(chǎn)物反應(yīng)原性的鑒定
        2 結(jié)果與分析
            2.1 HcP基因的擴(kuò)增、克隆及測序
            2.2 重組表達(dá)載體pPIC9K-HcP的構(gòu)建及PCR和雙酶切鑒定
            2.3 重組酵母菌株GS115/pPIC9K-HcP的鑒定
            2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測
            2.5 目的蛋白的純化
            2.6 純化產(chǎn)物反應(yīng)原性鑒定
        3 討論
            3.1 載體pPIC9K-HcP的構(gòu)建
            3.2 重組酵母表達(dá)株的篩選
            3.3 外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的影響因素
    實驗二 重組蛋白的生物學(xué)特性初探
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
            1.2 方法
        2 結(jié)果與分析
            2.1 HcP表達(dá)產(chǎn)物的紅血球凝集活性
            2.2 HcP表達(dá)產(chǎn)物對羊的血紅蛋白的降解活性
            2.3 HcP表達(dá)產(chǎn)物對羊的IgG的降解作用
        3 討論
            3.1 HcP蛋白的紅血球凝集活性
            3.2 HcP蛋白降解血紅蛋白的活性
            3.3 HcP蛋白降解免疫球蛋白(IgG)的活性
結(jié)論
創(chuàng)新點
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡介
致謝
導(dǎo)師評閱表



本文編號：3172885