旨在制備禽致病性大腸桿菌（APEC）染色體編碼外膜蛋白（cOmpT）的特異性單克隆抗體,本研究利用實驗室已構(gòu)建的APEC cOmpT重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-compT,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,獲得以包涵體形式存在的約36 ku的重組蛋白cOmpT,利用尿素濃度梯度透析復(fù)性獲得純化蛋白cOmpT,并以此免疫BALB/c小鼠。建立間接ELISA檢測方法,最適抗原包被濃度為0.625μg·mL^-1,最適血清稀釋度為1∶6 400。4次免疫后取小鼠脾進(jìn)行細(xì)胞融合,采用有限稀釋法多輪篩選后得到3株能穩(wěn)定分泌針對cOmpT蛋白的單克隆抗體,分別命名為1G8、2C3和2G3,均為IgG2b亞類。3株雜交瘤細(xì)胞上清ELISA抗體效價分別為1∶200、1∶3 200和1∶3 200。Western blot結(jié)果顯示,3株單抗均能與cOmpT發(fā)生特異性反應(yīng),而不與其他受檢菌發(fā)生交叉反應(yīng)。運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)對compT基因進(jìn)行截短表達(dá),對單克隆抗體針對的cOmpT抗原表位進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示單抗1G8、2C3和2G3識別的抗原表位分別是⁸³DQDWMDS^8... 

【文章來源】：畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2020,51(12)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：11 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞
        1.1.2 實驗動物
        1.1.3 主要試劑
    1.2 方法
        1.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
        1.2.2 動物免疫
        1.2.3 間接ELISA檢測方法的建立
        1.2.4 細(xì)胞融合及篩選
        1.2.5 單抗亞類鑒定
        1.2.6 Western blot鑒定
        1.2.7 單抗特異性鑒定
        1.2.8 交叉反應(yīng)性鑒定
        1.2.9 抗原表位的初步定位
        1.2.10 抗原表位的精確定位
        1.2.11 抗原表位分析
2 結(jié) 果
    2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化
        2.1.1 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.1.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.1.3 重組蛋白的純化
    2.2 間接ELISA方法的建立
    2.3 小鼠血清效價的檢測
    2.4 細(xì)胞融合與篩選
    2.5 抗體效價鑒定
    2.6 單抗亞類鑒定
    2.7 Western blot鑒定
    2.8 單抗特異性鑒定
    2.9 交叉反應(yīng)性鑒定
    2.10 抗原表位鑒定
        2.10.1 抗原表位的初步定位
        2.10.2 抗原表位的精確定位
    2.11 抗原表位分析
3 討 論
4 結(jié) 論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]禽致病性大腸桿菌E058株compT、pompT基因突變株的構(gòu)建及其致病性評價[D]. 陳娟.揚(yáng)州大學(xué) 2016
[4]尿路致病性大腸埃希菌外膜蛋白T致病相關(guān)的功能研究[D]. 趙鐵.南方醫(yī)科大學(xué) 2012



本文編號：3171899