腸球菌是一類廣泛分布于人和溫血動物腸道的革蘭氏陽性球菌,且存在各種環(huán)境介質(zhì)中,其中糞腸球菌和屎腸球菌是優(yōu)勢菌種。20世紀70年代,醫(yī)院內(nèi)腸球菌感染的增多,以及抗生素的濫用,出現(xiàn)了腸球菌耐藥菌株,其對人和動物的致病性也受到了人們的重視,但獸醫(yī)臨床上對腸球菌的研究相對較少。腸球菌是一種重要的機會致病菌,當機體抵抗力低下時,會引起發(fā)病,腸球菌在院內(nèi)主要引起心內(nèi)膜炎和菌血癥,還可引起多種感染。腸球菌具有形成生物被膜（Bacterial biofilm, BF）的能力,促使腸球菌感染增多且更難以治療。BF不僅為細菌提供良好的避護所,而且機體防御系統(tǒng)及抗菌藥物難以將其清除。對糞腸球菌BF及其機理進行深入研究,在感染的防治中有重要意義。而腸球菌兒種含有LPXTG基序樣蛋白,如表面蛋白（Esp）,膠原蛋白黏附素（Ace）,聚類物質(zhì)（As）,在腸球菌生物被膜的形成過程中可能起到重要作用,因此本試驗通過對Esp和Ace的研究,以及相關(guān)毒力因子esp、as、 ace、gelE的表達情況與生物被膜形成的關(guān)系。以期為為制備單抗、開發(fā)疫苗及其致病機制研究奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)GenBank公布的腸球菌esp基因序列片段... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學河南省

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
文獻綜述
    1 腸球菌概述
        1.1 腸球菌的分類和生物學特性
        1.2 腸球菌的流行性
        1.3 腸球菌的應(yīng)用
        1.4 腸球菌主要毒力因子及其致病性
    2 腸球菌的生物被膜
        2.1 生物被膜的定義
        2.2 生物被膜的形成
        2.3 生物被膜形成相關(guān)因子
            2.3.1 腸球菌表面蛋白(Enterococcal Surface Protein)
            2.3.2 菌毛(Pill)
            2.3.3 自溶素(autolysin)
            2.3.4 明膠酶(Gelatinase,GelE)
            2.3.5 糞腸球菌心內(nèi)膜炎抗原(Enterococcus faecalis endocarditis antigen,EfaA)11
            2.3.6 聚集物質(zhì)(AS)
            2.3.7 膠原蛋白黏附素(Ace)
            2.3.7 胞外DNA(extracellular DNA,eDNA)
            2.3.8 葡萄糖(glucose)
引言
試驗一 豬源糞腸球菌表面蛋白(Esp)的基因克隆及原核表達及純化
    1 材料
        1.1 菌株與載體
        1.2 主要儀器
        1.3 主要試劑
        1.4 主要溶液和培養(yǎng)基的配制
    2 方法
        2.1 DNA模板的制備
        2.2 引物選擇與合成
        2.3 Esp基因的擴增
            2.3.1 PCR的反應(yīng)體系
            2.3.2 PCR反應(yīng)程序Esp的擴增在PCR儀上進行,反應(yīng)程序如下
            2.3.3 PCR產(chǎn)物的回收與純化
        2.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定
            2.4.1 PCR產(chǎn)物與T載體的連接
            2.4.2 感受態(tài)細胞制備
            2.4.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            2.4.4 小量重組質(zhì)粒的篩選和提取
            2.4.5 重組質(zhì)粒的鑒定
        2.5 檢測腸球菌esp基因攜帶率
        2.6 糞腸球菌表面蛋白Esp的原核表達
            2.6.1 引物選擇與合成
            2.6.2 Esp的擴增
                2.6.2.1 PCR反應(yīng)體系
                2.6.2.2 PCR反應(yīng)程序
                2.6.2.3 PCR產(chǎn)物的回收與純化
                2.6.2.4 Esp雙酶切
            2.6.3 空載體的制備
                2.6.3.1 空載體菌的純化和擴增
                2.6.3.2 空載體的小量提取
                2.6.3.3 原核表達質(zhì)粒(空載體)的雙酶切
            2.6.4 重組載體的構(gòu)建與鑒定
                2.6.4.1 連接反應(yīng)
                2.6.4.2 表達菌BL_(21)(DE_3)感受態(tài)細胞制備
                2.6.4.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
                2.6.4.4 重組質(zhì)粒的篩選和提取
                2.6.4.5 重組質(zhì)粒的鑒定
            2.6.5 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達及純化
                2.6.5.1 IPTG最佳誘導(dǎo)濃度的確定
                2.6.5.2 IPTG最佳誘導(dǎo)時間的確定
                2.6.5.3 大量誘導(dǎo)表達
                2.6.5.4 融合表達產(chǎn)物的可溶性鑒定
                2.6.5.5 鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化
        2.7 Western blot
    3 結(jié)果與分析
        3.1 目的基因的擴增
        3.2 擴增目的基因的序列測序
        3.3 腸球菌Esp基因的攜帶率
        3.4 腸球菌表面蛋白Esp原核表達結(jié)果
            3.4.1 目的基因的擴增
            3.4.2 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化
            3.4.3 重組蛋白的純化
            3.4.4 Western blot
    4 討論
試驗二 編碼esp等LPTXG基序樣物質(zhì)的基因?qū)ι锉荒ば纬傻挠绊?br>    1 材料與方法
        1.1 試驗菌株
        1.2 主要試劑和儀器
        1.3 主要溶液和培養(yǎng)基的配制
        1.4 引物
        1.5 方法
            1.5.1 剛果紅培養(yǎng)基篩選生物被膜菌
            1.5.2 糞腸球菌總RNA的提取
            1.5.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
            1.5.4 實時熒光定量PCR檢測生物被膜陽性菌與生物被膜陰性菌中各基因的表達情況
            1.5.5 數(shù)據(jù)分析
    2 結(jié)果
        2.1 剛果紅培養(yǎng)基鑒定結(jié)果
        2.2 糞腸球菌總RNA的提取結(jié)果
        2.3 基因熔解曲線
        2.4 實時熒光定量PCR檢測生物被膜陽性菌與生物被膜陰性菌中各基因的表達情況
    3 討論
試驗三 豬源糞腸球菌Ace的黏附阻斷及其對生物被膜形成的影響
    1 材料
        1.1 菌株、細胞與載體
        1.2 主要儀器
        1.3 主要溶液及培養(yǎng)基的配制
    2 方法
        2.1 IPEC-J2細胞的培養(yǎng)
        2.2 腸球菌的細胞黏附
        2.3 Ace對糞腸球菌生物被膜形成能力影響
        2.4 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果與分析
        3.1 黏附與抑制結(jié)果
        3.2 Ace對糞腸球菌生物被膜形成能力影響結(jié)果
    4 討論
全文總結(jié)
參考文獻
Abstract
發(fā)表論文


【參考文獻】：
期刊論文
[1]糞腸球菌生物被膜相關(guān)因子的研究進展[J]. 卜倩倩,伍勇.  國際檢驗醫(yī)學雜志. 2012(08)
[2]腸球菌毒力因子的研究進展[J]. 周霞,王東,王曉蘭,劉雪梅.  中國獸醫(yī)學報. 2011(08)
[3]仔豬關(guān)節(jié)炎糞腸球菌生物學特性研究[J]. 王亞賓,張祥,胡清林,孟振北,陳麗穎,陳小麗,崔保安.  河南農(nóng)業(yè)大學學報. 2011(02)
[4]正常人腸道腸球菌esp基因與生物膜形成關(guān)系的初探[J]. 戴銳睿,楊洋,熊鹿言,李晶潔,權(quán)泰鵬,余倩.  四川大學學報(醫(yī)學版). 2010(05)
[5]糞腸球菌總RNA提取方法的比較研究[J]. 鄒彬彬,漆涌,伍勇.  湖南師范大學學報(醫(yī)學版). 2009(02)
[6]21例鉛黃腸球菌感染的臨床特征分析[J]. 謝琴秀,熊自忠.  安徽醫(yī)藥. 2008(10)
[7]鶉雞腸球菌致亞急性感染性心內(nèi)膜炎1例[J]. 王東文,張永,肖志斌.  實用醫(yī)學雜志. 2008(16)
[8]嗜酸乳桿菌和兩歧雙歧桿菌體外粘附Caco-2細胞及其對病原菌粘附性能的影響[J]. 郭彤,胥保華,馬玉龍,魏華.  中國獸醫(yī)學報. 2008(05)
[9]4株鴨源腸球菌的鑒定和致病性[J]. 韓梅紅,谷長勤,胡薛英,周詩其,楊峻,邵華斌,程國富.  中國獸醫(yī)學報. 2007(06)
[10]腸球菌部分致病基因和表型的檢測[J]. 馬立艷,許淑珍,馬紀平.  中華檢驗醫(yī)學雜志. 2005(05)



本文編號：3166688