哺乳動物骨骼肌是由各種不同類型的肌纖維鑲嵌而成的，而不同類型肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MyHC）的表達情況是造成不同類型肌纖維的主要原因。目前已知的肌球蛋白重鏈家族包含8種亞型，其中MyHC-IIb在商品豬中的表達量要顯著高于其在中國地方豬種中的表達量，然而造成這種差異表達的內(nèi)在機制尚且無人研究。本研究使用qRT-PCR、C2C12細胞轉(zhuǎn)染、熒光素酶檢測以及Western Blot等方法，對商品豬中MyHC-IIb基因表達上調(diào)的因素進行了初步的分析。結(jié)果如下：1使用熒光定量PCR的方法比較了萊蕪豬（n=5）和大長雜交豬（n=4）背最長肌中MyHC-IIb mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)MyHC-IIb mRNA在大長雜交豬中的表達量顯著高于其在萊蕪豬中的表達量（P=0.013<0.05）。2刪除實驗結(jié)果表明從轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1024bp刪除到-187bp之后，MyHC-IIb表達量顯著下降，分析發(fā)現(xiàn)在這段啟動子區(qū)域內(nèi)存在三個E-box序列，分別突變這3個E-box序列，結(jié)果使得MyHC-IIb表達量都顯著下降（P=0.036<0.05）。3另外，在My... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
英文縮略詞
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 豬肌肉組織
    1.2 豬骨骼肌組織
        1.2.1 豬骨骼肌結(jié)構(gòu)
        1.2.2 豬骨骼肌纖維分類
        1.2.3 肌纖維類型與肉品質(zhì)的關(guān)系
    1.3 肌球蛋白與肌球蛋白重鏈
        1.3.1 肌球蛋白
        1.3.2 肌球蛋白重鏈
    1.4 肌生成的分子調(diào)控機制
        1.4.1 形態(tài)發(fā)育和肌肉發(fā)育
        1.4.2 基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控肌生成
    1.5 本研究的目的和意義
2 實驗材料和方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗動物及其處理
        2.1.2 主要實驗儀器
        2.1.3 主要試劑及來源
        2.1.4 主要數(shù)據(jù)庫及生物軟件
        2.1.5 常用試劑的配制
    2.2 試驗方法
        2.2.1 試驗中用到的引物序列
        2.2.2 總 RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄
            2.2.2.1 前處理
            2.2.2.2 組織總 RNA 提取與純化（Trizol 法）
            2.2.2.3 RNA 品質(zhì)和質(zhì)量檢測
            2.2.2.4 Dnase I 處理
            2.2.2.5 RNA 的反轉(zhuǎn)錄以得到 cDNA
        2.2.3 實時熒光定量 PCR
        2.2.4 MyHC-IIb 啟動子區(qū)的克隆及多態(tài)性分析
            2.2.4.1 MyHC-IIb 啟動子區(qū)的克隆
            2.2.4.2 MyHC-IIb 啟動子區(qū)的多態(tài)性分析
        2.2.5 表達載體構(gòu)建及質(zhì)粒的去內(nèi)毒素處理
            2.2.5.1 表達載體構(gòu)建
            2.2.5.2 質(zhì)粒的去內(nèi)毒素處理
        2.2.6 C2C12 細胞培養(yǎng)
            2.2.6.1 C2C12 細胞的復蘇
            2.2.6.2 C2C12 細胞的消化傳代
            2.2.6.3 C2C12 細胞的凍存
        2.2.7 轉(zhuǎn)染及 Dual-Luciferase 報告基因檢測
            2.2.7.1 細胞轉(zhuǎn)染
            2.2.7.2 Dual-Luciferase 報告基因檢測
        2.2.8 總蛋白的提取和蛋白濃度檢測
            2.2.8.1 總蛋白的提取
            2.2.8.2 蛋白濃度檢測
        2.2.9 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡分析(Western blot)
            2.2.9.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
            2.2.9.2 蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)分析
        2.2.10 統(tǒng)計分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 總 RNA 提取
    3.2 萊蕪豬和長白豬背最長肌中 MyHC-IIb mRNA 表達水平對比
    3.3 MyHC-IIb 啟動子區(qū)的克隆及區(qū)多態(tài)性分析
        3.3.1 MyHC-IIb 啟動子區(qū)的克隆
        3.3.2 MyHC-IIb 啟動子區(qū)多態(tài)性分析
    3.4 C2C12 細胞的培養(yǎng)
    3.5 SNP 位點突變載體熒光素酶報告基因檢測結(jié)果
    3.6 MyHC-IIb 啟動子不同長度片段載體的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果
        3.6.1 MyHC-IIb 啟動子不同長度片段載體的構(gòu)建
        3.6.2 MyHC-IIb 啟動子區(qū)刪除實驗結(jié)果
    3.7 E-box 突變載體熒光素酶報告基因檢測結(jié)果
    3.8 總蛋白的提取和蛋白濃度檢測
    3.9 蛋白質(zhì)印跡分析(Westernblot)
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]長白豬主要性能測定及遺傳參數(shù)估計研究[J]. 周立平.  湖南農(nóng)業(yè)科學. 2011(07)
[2]肌纖維類型及其對豬肉品質(zhì)影響的研究進展[J]. 任列嬌,趙素梅,胡洪,郭雷,高士爭.  云南農(nóng)業(yè)大學學報. 2010(01)
[3]運動與肌球蛋白重鏈研究綜述[J]. 蘇艷紅,周越,王瑞元.  天津體育學院學報. 2008(04)
[4]胚胎發(fā)育中骨骼肌組織的形成及調(diào)控[J]. 張江麗.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2007(21)
[5]禽肉組織學性狀及其與肉質(zhì)的關(guān)系[J]. 潘迎麗,劉勝軍,耿忠誠,賈志遠.  家畜生態(tài)學報. 2006(06)
[6]豬背最長肌肌纖維類型的發(fā)育性變化及其品種和性別特點[J]. 楊曉靜,趙茹茜,陳杰,胥清富,韋習會,陳杰.  中國獸醫(yī)學報. 2005(01)
[7]山東地方豬種資源的現(xiàn)狀和養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[J]. 曾勇慶.  中國畜牧雜志. 2004(02)
[8]江西玉山豬肌肉組織學特征與肉質(zhì)的關(guān)系[J]. 王亞鳴,劉龍芳.  江西農(nóng)業(yè)大學學報. 1994(03)
[9]金華豬及其雜種肌肉組織學特性與肉質(zhì)的關(guān)系[J]. 沈元新,徐繼初.  浙江農(nóng)業(yè)大學學報. 1984(03)
[10]豬肉肌纖維粗細與肉質(zhì)的關(guān)系[J]. 川井田博,郁明發(fā).  國外畜牧學(豬與禽). 1983(03)



本文編號：3165947