發(fā)布時(shí)間：2021-04-26 14:17

　　諾維氏梭菌（Clostridium novyi）曾被稱為水腫梭菌（Clostridium oedematiens）、水腫桿菌、第二型惡性水腫桿菌、巨大桿菌和水牛梭菌等,它是羊黑疫的致病菌。諾維氏梭菌廣泛存在于自然界特別是土壤之中,飼草被芽胞體污染后,經(jīng)羊采食,芽胞從胃腸壁經(jīng)目前尚未闡明的途徑到達(dá)肝臟引起發(fā)病。羊、牛均可感染。該菌可以使1歲以上的綿羊發(fā)病,山羊也可以患此病,牛僅偶發(fā)感染。由諾維氏梭菌引起的羊黑疫發(fā)病急,死亡快,家畜往往還沒(méi)有表現(xiàn)出明顯癥狀就死亡,部分病例可拖延1² d,但沒(méi)有超過(guò)3 d的,給畜牧業(yè)帶來(lái)了巨大損失。因此,亟需建立在羊群快速鑒定諾維氏梭菌的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù),如ELISA診斷方法等。諾維氏梭菌屬嚴(yán)格厭氧菌,其生長(zhǎng)繁殖對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求和環(huán)境要求高,常見(jiàn)的培養(yǎng)基不能滿足其需要。為了獲得高密度的細(xì)菌培養(yǎng)物,滿足實(shí)驗(yàn)室或疫苗生產(chǎn)的需要,須合成新的培養(yǎng)基;為了制備新的診斷試劑盒如ELISA試劑盒等,須制備天然毒素、單克隆抗體、多克隆抗體;為了獲得單克隆抗體和多克隆抗體,在天然毒素獲得困難的情況下,須用重組蛋白代替天然毒素。該病死亡快,為了實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)在羊群快速診... 

【文章來(lái)源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：75 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
項(xiàng)目資助
符號(hào)說(shuō)明
中文摘要
Abstract
1 引言
    1.1 諾維氏梭菌介紹
    1.2 相關(guān)菌介紹
        1.2.1 腐敗梭菌
        1.2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌
    1.3 諾維氏梭菌培養(yǎng)現(xiàn)狀
    1.4 PCR技術(shù)
    1.5 本課題的研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株及細(xì)胞
        2.1.2 主要的試劑及溶液的配制
        2.1.3 主要試驗(yàn)儀器
    2.2 方法
        2.2.1 菌種復(fù)蘇
        2.2.2 菌種保存
        2.2.3 諾維氏梭菌增菌培養(yǎng)基探索
        2.2.4 諾維梭菌、腐敗梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR檢測(cè)
        2.2.5 天然毒素的制備
        2.2.6 諾維氏梭菌α天然毒素蛋白鑒定的SDS-PAGE檢測(cè)技術(shù)
        2.2.7 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染
        2.2.8 諾維氏梭菌重組蛋白的原核表達(dá)
        2.2.9 單克隆抗體的制備
        2.2.10 BALB/c小鼠單克隆抗體腹水的制備
        2.2.11 BALB/c小鼠單克隆抗體腹水的純化
        2.2.12 單克隆抗體的效價(jià)檢測(cè)
        2.2.13 單克隆抗體特異性的鑒定
        2.2.14 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株分泌單克隆抗體穩(wěn)定性的測(cè)定
        2.2.15 小鼠單克隆抗體Ig亞類的鑒定
        2.2.16 多克隆抗體的制備
3 結(jié)果和分析
    3.1 菌株培養(yǎng)及其特性分析結(jié)果
    3.2 諾維氏梭菌增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)效果
    3.3 諾維梭菌的PCR檢測(cè)結(jié)果
        3.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.2 PCR檢測(cè)的特異性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
        3.3.3 PCR檢測(cè)的臨床應(yīng)用效果
    3.4 諾維氏梭菌天然毒素的純化結(jié)果
    3.5 諾維氏梭菌動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)
    3.6 諾維氏梭菌α毒素重組蛋白的原核表達(dá)
        3.6.1 基因合成和構(gòu)建結(jié)果
        3.6.2 質(zhì)粒構(gòu)建酶切結(jié)果
        3.6.3 諾維氏梭菌重組蛋白表達(dá)結(jié)果
        3.6.4 諾維氏梭菌重組蛋白Western Blot驗(yàn)證結(jié)果
    3.7 諾維氏梭菌單克隆抗體的制備結(jié)果
        3.7.1 免疫BALB/c小鼠抗體效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果
        3.7.2 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的建立結(jié)果
        3.7.3 雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況
    3.8 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株分泌單克隆抗體穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果
    3.9 單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果
    3.10 腹水的純化及濃度測(cè)定結(jié)果
    3.11 單克隆抗體的特性鑒定
        3.11.1 單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果
        3.11.2 單克隆抗體特異性鑒定結(jié)果
        3.11.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.12 諾維氏梭菌多克隆抗體的制備結(jié)果
4 討論
    4.1 選取重組蛋白的原因
    4.2 天然α毒素的制備及純化
    4.3 雜交瘤細(xì)胞的融合和篩選
    4.4 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)
    4.5 單克隆抗體的純化
    4.6 單克隆抗體特異性的鑒定
    4.7 多克隆抗體的制備
    4.8 單克隆抗體和多克隆抗體制備出來(lái)的意義
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
發(fā)表論文情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]淺談羊黑疫防治[J]. 魏麗君.  山東畜牧獸醫(yī). 2018(03)
[2]羊黑疫的診斷與防治[J]. 王菊文,韓濤,任禾,馮學(xué)俊,沈辰峰,王杰,樊華,陳世軍.  現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2018(03)
[3]羊黑疫的流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、鑒別診斷及防控措施[J]. 王楊,王軍.  現(xiàn)代畜牧科技. 2018(02)
[4]羊黑疫的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室診斷及防控措施[J]. 柴曉虹.  現(xiàn)代畜牧科技. 2017(11)
[5]羊梭菌病的預(yù)防和治療[J]. 張成.  中國(guó)動(dòng)物保健. 2017(06)
[6]腐敗梭菌引起的羊疫病防治[J]. 丁環(huán).  山東畜牧獸醫(yī). 2017(06)
[7]羊諾維梭菌病的診治[J]. 王仁虎.  鄉(xiāng)村科技. 2016(33)
[8]豬惡性水腫病的流行、診斷及防治措施[J]. 朱萬(wàn)柏,周宏亮,周立新.  現(xiàn)代畜牧科技. 2016(11)
[9]山羊傳染性壞死性肝炎的診治[J]. 鄧廣福.  當(dāng)代畜牧. 2016(29)
[10]產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素免疫組化檢測(cè)方法的建立[J]. 秦貴平,陳長(zhǎng)俊,林曉佳,吳潔,楊文浩,王海榮,柴同杰.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(10)

碩士論文
[1]產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素抗體捕獲ELISA檢測(cè)方法的建立和初步應(yīng)用[D]. 楚國(guó)茹.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[2]不同源產(chǎn)氣莢膜梭菌交叉感染及類毒素疫苗免疫保護(hù)效果比較[D]. 溫新水.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[3]產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素單克隆抗體的制備及鑒定[D]. 李翠松.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[4]C型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素疫苗與抗毒素血清的制備研究[D]. 樊金.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[5]產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素單克隆抗體的制備及鑒定[D]. 劉萌萌.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[6]產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[D]. 孫佳芝.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[7]羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定與α毒素的原核表達(dá)和免疫原性研究[D]. 李娜.石河子大學(xué) 2013
[8]腐敗梭菌α毒素基因克隆和表達(dá)的研究[D]. 張燕.河北師范大學(xué) 2006



本文編號(hào)：3161558