發(fā)布時間：2021-04-26 08:41

　　口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）嚴重地影響著世界各國畜牧業(yè)的發(fā)展，目前對該病的控制，主要采取診斷檢測與疫苗免疫相結(jié)合的方法。在FMD的診斷技術(shù)中，最有效、最經(jīng)濟的方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。傳統(tǒng)的ELISA方法是以全病毒作為抗原檢測血清抗體，但在全病毒的生產(chǎn)過程中存在著病毒擴散的危險，因此，將口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）結(jié)構(gòu)蛋白基因進行體外表達，將純化的蛋白作為檢測方法的抗原是一種更安全、更有效的方法。另外，將純化的蛋白免疫動物，誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生抗體，可用于疫苗的研制，為FMD亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。本研究根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的豬O型FMDV基因序列（JN998085.1）合成了FMDV結(jié)構(gòu)蛋白前體蛋白P1基因。以上海生工生物工程股份有限公司合成的pUC57-P1質(zhì)粒為模板，擴增得到了VP0、VP1、VP3基因，利用SUMO融合表達載體在大腸埃希氏菌BL21（DE3） plysS中表達，分別獲得了45ku、35ku和35ku的融合蛋白SUMO-VP0、SUMO-VP1及SUMO-... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：84 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 口蹄疫
        1.1.1 口蹄疫的危害及流行現(xiàn)狀
        1.1.2 口蹄疫病原特征
        1.1.3 O 型口蹄疫病毒抗原位點研究進展
    1.2 口蹄疫診斷技術(shù)研究進展
        1.2.1 臨床診斷
        1.2.2 生物學(xué)診斷技術(shù)
        1.2.3 血清學(xué)診斷
        1.2.4 分子生物學(xué)技術(shù)
        1.2.5 其他方法
    1.3 本研究的目的及意義
第二章 豬 O 型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因 VP0、VP1、VP3的克隆及表達載體的構(gòu)建
    2.1 材料
        2.1.1 病毒基因、菌株與載體
        2.1.2 主要試劑及酶
        2.1.3 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 病毒基因合成
        2.2.2 引物的設(shè)計與合成
        2.2.3 VP0、VP1、VP3 基因片段的 PCR 擴增
        2.2.4 VP0、VP1、VP3 基因 PCR 產(chǎn)物的回收
        2.2.5 VP0、VP1、VP3 基因的克隆
        2.2.6 感受態(tài)細胞的制備
        2.2.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coli DH5
        2.2.8 重組質(zhì)粒的提取
        2.2.9 重組質(zhì)粒的 PCR 鑒定
        2.2.10 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.2.11 重組質(zhì)粒的測序鑒定
        2.2.12 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.13 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 E.coli DH5
        2.2.14 原核表達質(zhì)粒的提取
        2.2.15 原核表達質(zhì)粒的 PCR 鑒定
        2.2.16 原核表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.2.17 原核表達質(zhì)粒的測序鑒定
        2.2.18 原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21（DE3）plysS
        2.2.19 原核表達質(zhì)粒的提取及鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 VP0、VP1、VP3 基因的擴增
        2.3.2 重組質(zhì)粒的 PCR 鑒定
        2.3.3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.3.4 重組質(zhì)粒的測序鑒定
        2.3.5 原核表達質(zhì)粒的 PCR 鑒定
        2.3.6 原核表達質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.3.7 原核表達質(zhì)粒的測序鑒定
    2.4 討論
第三章 豬 O 型口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的原核表達及可溶性表達條件的摸索
    3.1 材料
        3.1.1 主要試劑及酶
        3.1.2 主要儀器
    3.2 方法
        3.2.1 原核表達質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達
        3.2.2 SDS-PAGE 分析
        3.2.3 Western blot 分析
        3.2.4 目的蛋白大量表達的預(yù)處理
        3.2.5 目的蛋白可溶性表達條件的摸索
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 SDS-PAGE 分析結(jié)果
        3.3.2 Western blot 分析結(jié)果
        3.3.3 目的蛋白大量表達的預(yù)處理結(jié)果
        3.3.4 目的蛋白可溶性表達條件的摸索
    3.4 討論
第四章 SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3 及 VP3 蛋白的純化
    4.1 材料
        4.1.1 主要試劑及酶
        4.1.2 主要儀器
    4.2 方法
        4.2.1 透析袋的處理及保存
        4.2.2 蛋白的重折疊處理
        4.2.3 通過 BCA 蛋白定量分析法測定樣品中蛋白含量
        4.2.4 蛋白的純化
        4.2.5 蛋白的濃縮
        4.2.6 測定濃縮后蛋白樣品中蛋白含量
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 純化產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析
        4.3.2 VP3 蛋白的特異性分析
    4.4 討論
第五章 SUMO-VP0、SUMO-VP1、SUMO-VP3 及 VP3 蛋白間接 ELISA 方法的建立
    5.1 材料
        5.1.1 主要試劑及酶
        5.1.2 主要儀器
    5.2 方法
        5.2.1 方陣滴定法確定蛋白最佳包被濃度及血清最佳稀釋度
        5.2.2 最佳抗原包被條件的確定
        5.2.3 最佳封閉液的確定
        5.2.4 最佳封閉條件的確定
        5.2.5 最佳血清稀釋液的確定
        5.2.6 最佳血清作用時間的確定
        5.2.7 酶標二抗最佳工作濃度的確定
        5.2.8 酶標二抗最佳作用時間的確定
        5.2.9 底物最佳作用時間的確定
        5.2.10 臨界值的確定
        5.2.11 特異性試驗
        5.2.12 敏感性試驗
        5.2.13 重復(fù)性試驗
        5.2.14 對比試驗
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 方陣滴定法確定蛋白最佳包被濃度和最佳血清稀釋度
        5.3.2 抗原最佳包被條件的確定
        5.3.3 最佳封閉液的確定
        5.3.4 封閉時間的確定
        5.3.5 最佳血清稀釋液的確定
        5.3.6 血清最佳作用時間的確定
        5.3.7 酶標二抗最佳工作濃度的確定
        5.3.8 酶標二抗最佳作用時間的確定
        5.3.9 底物最佳作用時間的確定
        5.3.10 最終反應(yīng)條件的確定
        5.3.11 臨界值的確定
        5.3.12 特異性試驗
        5.3.13 敏感性試驗
        5.3.14 重復(fù)性試驗
        5.3.15 對比試驗
    5.4 討論
第六章 SUMO-VP0、SUMO-VP1 及 SUMO-VP3 蛋白的豚鼠免疫試驗
    6.1 材料
        6.1.1 主要試劑及實驗動物
        6.1.2 主要儀器
    6.2 方法
        6.2.1 抗原的制備
        6.2.2 動物分組和免疫程序
        6.2.3 豚鼠血清中 FMDV 抗體的檢測
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 豚鼠血清中 FMDV 抗體的檢測
    6.4 討論
第七章 結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]口蹄疫診斷技術(shù)研究進展[J]. 武剛,王洪梅,劉曉,宋玲玲,陳莉莉,仲躋峰,何洪彬.  家畜生態(tài)學(xué)報. 2011(02)
[2]口蹄疫診斷技術(shù)的研究進展[J]. 劉明,徐娜,李志勇,柳紀省.  生物技術(shù)通報. 2010(05)
[3]口蹄疫病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J]. 秦智鋒,曾少靈,阮周曦,陳兵,曹琛福,花群義,呂建強,葉奕優(yōu),范萬紅,畢英佐.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2008(05)
[4]基因芯片技術(shù)及口蹄疫病毒基因芯片研究進展[J]. 王建東,郭建宏,楊春生,劉在新.  動物醫(yī)學(xué)進展. 2007(S1)
[5]口蹄疫病毒VP2基因的原核表達及抗原性檢測[J]. 曲哲會,王君偉,郭曉秋,李剛,李洪濤.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2007(02)
[6]環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增技術(shù)及其應(yīng)用研究進展[J]. 常小斌,劉洵,程天印,王小君,陳宇明.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2006(12)
[7]應(yīng)用寡核苷酸芯片檢測豬口蹄疫病毒的初步研究[J]. 楊林,張桂紅,鐘植文,廖明,王升啟.  中國畜牧獸醫(yī). 2006(12)
[8]口蹄疫檢測能力比對試驗的結(jié)果分析[J]. 周碧君,李謙,汪德生.  山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報. 2006(02)
[9]口蹄疫診斷技術(shù)研究進展[J]. 王莉娟,徐天剛,趙云玲,陸明哲,陳義平,曹洪敬,蔡麗娟.  中國畜牧獸醫(yī). 2005(03)
[10]口蹄疫病毒P1基因在大腸桿菌中的高效表達及其生物活性的初步分析[J]. 余曉嵐,肖少波,方六榮,胡夢雨,嚴琳,董曉輝,陳煥春.  生物工程學(xué)報. 2005(01)

碩士論文
[1]�？谔阋卟《綱P2-ELISA和3B表位串聯(lián)肽間接ELISA試劑盒的研制[D]. 張潤祥.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[2]口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP1 C末端的免疫原性研究及VP1-ELISA方法的建立[D]. 王光華.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[3]口蹄疫病毒環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法的建立與評價[D]. 孫曉智.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007



本文編號：3161111