豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染豬小腸細(xì)胞致使細(xì)胞死亡脫落從而引起的急性傳染病,主要臨床癥狀是水樣腹瀉、嘔吐,對(duì)7日齡以?xún)?nèi)哺乳仔豬尤為易感。自2010年以來(lái),以變異PEDV為主要病原體的PED在我國(guó)爆發(fā),并迅速席卷全國(guó)及周邊亞洲國(guó)家,給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PEDV為典型的單股正鏈RNA冠狀病毒,與其他冠狀病毒一樣具有四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白分別為纖突（Spike,S）蛋白、膜（Membrane,M）蛋白、小膜蛋白（Envelope,E）和核衣殼（Nucleocapsid,N）,其中N蛋白是一個(gè)重要的結(jié)構(gòu)蛋白,并且高度保守,因此篩選PEDV N蛋白與宿主細(xì)胞的互作蛋白,以及篩選針對(duì)N蛋白抗原表位,對(duì)于探尋PEDV的致病機(jī)制和特異性新型疫苗研究等提供幫助。本實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:（1）為了獲得與PEDV N蛋白相互作用的宿主蛋白。本研究構(gòu)建豬流行性腹瀉病毒N蛋白基因的重組載體p GBKT7-N,以其作為誘餌質(zhì)粒,采用酵母雙雜交方法,經(jīng)過(guò)兩次缺失培養(yǎng)基篩選... 

【文章來(lái)源】：河南科技大學(xué)河南省

【文章頁(yè)數(shù)】：66 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 PEDV概述
        1.1.1 PEDV的危害
        1.1.2 PEDV致病機(jī)理
        1.1.3 PEDV分子結(jié)構(gòu)特征及結(jié)構(gòu)蛋白功能
        1.1.4 PEDV細(xì)胞培養(yǎng)
        1.1.5 PEDV的診斷
        1.1.6 亞洲地區(qū)PEDV疫苗的研究
    1.2 酵母雙雜交技術(shù)概述
        1.2.1 酵母雙雜交技術(shù)的原理
        1.2.2 酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)勢(shì)
        1.2.3 酵母雙雜交技術(shù)的局限性
        1.2.4 酵母雙雜交技術(shù)的延伸
    1.3 研究目的和意義
第2章 誘餌載體pGBKT7-N的構(gòu)建和其毒性、自激活效應(yīng)檢測(cè)
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2.2 試劑
        2.2.3 培養(yǎng)基及試劑配制
        2.2.4 儀器設(shè)備
    2.3 方法
        2.3.1 誘餌載體pGBKT7-N的構(gòu)建
        2.3.2 重組質(zhì)粒pGBKT7-N轉(zhuǎn)化Y2H Gold感受態(tài)
        2.3.3 重組質(zhì)粒pGBKT7-N對(duì)酵母細(xì)胞毒性以及自激活性的檢測(cè)
    2.4 結(jié)果
        2.4.1 PCR擴(kuò)增N目的基因
        2.4.2 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-N的菌液PCR鑒定
        2.4.3 誘餌蛋白自激活與毒性檢測(cè)
    2.5 討論
第3章 酵母雙雜交法篩選與PEDV N蛋白相互作用的蛋白
    3.1 前言
    3.2 材料
        3.2.1 菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 試劑
        3.2.3 培養(yǎng)基及配制
        3.2.4 儀器設(shè)備
    3.3 方法
        3.3.1 pGBKT7-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞
        3.3.2 pGBKT7-N重組Y2H Gold酵母菌與豬肺泡巨噬細(xì)胞文庫(kù)酵母菌融合
        3.3.3 酵母雙雜交篩選PEDV N蛋白互作的宿主蛋白
        3.3.4 LGALS3和SNRPG蛋白回返實(shí)驗(yàn)和自激活實(shí)驗(yàn)
        3.3.5 Co-IP驗(yàn)證PEDV N蛋白與LGALS3、SNRPG的相互作用
    3.4 結(jié)果
        3.4.1 pGBKT7-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞
        3.4.2 酵母雙雜交篩選陽(yáng)性菌
        3.4.3 酵母雙雜交篩選PEDV N蛋白互作的宿主蛋白
        3.4.4 回返和自激活實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證N蛋白與LGALS3、SNRPG的相互作用
        3.4.5 Co-IP驗(yàn)證PEDV N蛋白與LGALS3、SNRPG的相互作用
    3.5 討論
第4章 PEDV N蛋白抗原表位鑒定
    4.1 前言
    4.2 材料
        4.2.1 菌種、質(zhì)粒和細(xì)胞
        4.2.2 主要試劑及試劑盒
        4.2.3 儀器設(shè)備
    4.3 方法
        4.3.1 N蛋白單克隆抗體腹水制備
        4.3.2 N區(qū)域表位鑒定
        4.3.3 N1-N2區(qū)域表位鑒定
    4.4 結(jié)果
        4.4.1 N蛋白單克隆抗體腹水制備
        4.4.2 N區(qū)分段表位鑒定
        4.4.3 N1-N2區(qū)分段表位鑒定
    4.5 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
縮略語(yǔ)詞匯表
附錄Ⅰ OMEGA Gel Extraction Kit具體步驟
附錄Ⅱ OMEGA Gel Extraction Kit具體步驟
附錄Ⅲ Western blot實(shí)驗(yàn)步驟
附錄Ⅳ 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞步驟
致謝
攻讀學(xué)位期間的研究成果



本文編號(hào)：3160852