羊口瘡病毒（Orf virus,ORFV）又稱接觸傳染性膿皰皮炎病毒（Contagious pustular dermatitis virus,CPDV）,主要引起綿羊和山羊的急性膿皰性皮膚病,且可感染人。為了研究陜北白絨山羊羊群中流行ORFV的生物學(xué)特性及流行特征,在某白絨山羊場采集具有典型羊口瘡癥狀的病羊結(jié)痂病料,用MDBK進行病毒分離培養(yǎng)。同時用特異性引物對ORFV的B2L和F1L基因全長進行擴增,并從核苷酸和氨基酸水平上對其同源性進行分析,同時對分離的毒株進行遺傳進化分析�；跅U狀病毒表達系統(tǒng),對ORFV的B2L、F1L和B2L-F1L分別進行真核表達,并通過SDS-PAGE、質(zhì)譜以及Western blot等方法進行鑒定,利用純化的重組蛋白建立ORFV的間接ELISA檢測方法,并檢測重組蛋白的免疫保護性,為羊口瘡病的防控提供了新思路。1.將疑似病料處理液在MDBK細胞上盲傳至5代后,可見產(chǎn)生明顯的CPE,經(jīng)PCR鑒定成功分離到了ORFV,將其命名為ORFV-Yulin。2.擴增的B2L基因和F1L基因大小分別為1 137 bp和1 029 bp。基于B2L基因核苷酸序列的遺傳... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 流行病學(xué)
    1.2 病原學(xué)
        1.2.1 病毒分類
        1.2.2 ORFV基因結(jié)構(gòu)
        1.2.3 病毒結(jié)構(gòu)
        1.2.4 ORFV引起的免疫反應(yīng)
        1.2.5 抑制細胞凋亡
        1.2.6 抑制NF-κB信號通路
        1.2.7 抑制干擾素通路
        1.2.8 抑制免疫細胞的遷移
        1.2.9 病毒的主要蛋白及功能
    1.3 羊口瘡疫苗的研制進展
    1.4 研究背景和意義
        1.4.1 研究背景
        1.4.2 研究目的和意義
    1.5 技術(shù)路線
2 試驗一 羊口瘡病毒的分離鑒定及遺傳進化分析
    2.1 材料方法
        2.1.1 流行病學(xué)調(diào)查
        2.1.2 病料
        2.1.3 載體、菌株與主要試劑
        2.1.4 配制的實驗溶液
        2.1.5 引物設(shè)計
        2.1.6 病毒分離
        2.1.7 B2L全長基因的擴增
        2.1.8 F1L全長基因的擴增
        2.1.9 B2L與F1L基因的克隆
        2.1.10 序列比對
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 流行情況調(diào)查
        2.2.2 病羊臨床癥狀
        2.2.3 病毒分離
        2.2.4 分離毒株的B2L全長基因的克隆
        2.2.5 分離毒株ORFV毒株B2L基因遺傳進化分析
        2.2.6 分離毒株的F1L基因全長的克隆
        2.2.7 分離毒株ORFV毒株F1L基因遺傳進化分析
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
3 試驗二 羊口瘡病毒B2L和F1L基因在昆蟲桿狀病毒中的表達
    3.1 材料方法
        3.1.1 載體、菌株與主要試劑
        3.1.2 配制的實驗溶液
        3.1.3 引物設(shè)計
        3.1.4 帶有酶切位點B2L基因的擴增
        3.1.5 B2L PCR產(chǎn)物的回收和純化
        3.1.6 桿狀病毒表達載體的構(gòu)建
        3.1.7 B2L在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達鑒定
        3.1.8 帶有酶切位點不含有信號肽的F1L基因（cF1L）的擴增
        3.1.9 cF1L PCR產(chǎn)物的回收和純化
        3.1.10 桿狀病毒表達載體的構(gòu)建
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 B2L基因昆蟲桿狀病毒表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 表達B2L桿狀病毒的包裝與收獲
        3.2.3 B2L蛋白在sf9細胞中的表達鑒定
        3.2.4 重組F1L基因（cF1L）的成功擴增
        3.2.5 pBac-cF1L載體的構(gòu)建以及酶切鑒定結(jié)果
        3.2.6 cF1L基因的表達與鑒定
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
4 試驗三 羊口瘡病毒B2L和F1L基因在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的串聯(lián)表達
    4.1 材料方法
        4.1.1 載體、菌株與主要試劑
        4.1.2 配制的實驗溶液
        4.1.3 引物設(shè)計
        4.1.4 融合基因GB2LcF1L的PCR擴增與pGT-GB2LcF1L的構(gòu)建
        4.1.5 GB2LcF1L在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中表達
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 rB2L融合基因的擴增
        4.2.2 GB2LcF1L融合基因的擴增
        4.2.3 pBac-GB2LcF1L載體的鑒定
        4.2.4 rB2LcF1L串聯(lián)蛋白在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的表達
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
5 實驗四B2L和F1L融合蛋白的抗原性研究
    5.1 材料方法
        5.1.1 載體、菌株、主要試劑與實驗動物
        5.1.2 配制的實驗溶液
        5.1.3 rB2LcF1L蛋白的純化及定量
        5.1.4 羊口瘡病毒抗血清的制備
        5.1.5 rB2LcF1L與抗羊口瘡病毒血清反應(yīng)的Western blot檢測
        5.1.6 間接ELISA方法的建立以及應(yīng)用
        5.1.7 rB2LcF1L蛋白的免疫保護
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 rB2LcF1L蛋白的純化
        5.2.2 rB2LcF1L串聯(lián)蛋白與抗羊口瘡病毒陽性血清的反應(yīng)
        5.2.3 間接ELISA最佳工作條件的確定
        5.2.4 特異性試驗
        5.2.5 敏感性試驗
        5.2.6 重復(fù)性試驗
        5.2.7 臨床樣本檢測
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
6 結(jié)論
7 創(chuàng)新點
8 展望
致謝
參考文獻
作者簡介
附錄


【參考文獻】：
期刊論文
[1]羊口瘡病毒F1L、B2L基因重組腺病毒構(gòu)建及對小鼠的免疫效果分析[J]. 陳曉,葛雷,戴建軍,李麗,張德福,吳彩鳳,張樹山.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2018(08)
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[3]羊口瘡病毒B2L基因DNA疫苗的構(gòu)建及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答[J]. 李鵬飛,馮將,鮮思美,劉嬡,李婷,包細明,張益,張素輝.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2018(04)
[4]羊口瘡病毒F1L基因真核表達質(zhì)粒構(gòu)建及對小鼠的免疫原性[J]. 李鵬飛,馮將,劉嬡,李婷,包細明,張益,鮮思美.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2018(02)
[5]羊IL-2基因和羊口瘡病毒B2L基因真核表達重組質(zhì)粒聯(lián)合免疫小鼠的效果評價[J]. 鮮思美,李鵬飛,馮將,劉嬡,李婷,包細明,張益,張素輝.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2017(08)
[6]江蘇省羊口瘡病毒的分離鑒定及B2L基因的遺傳進化分析[J]. 王秋霞,朱相儒,易成功,秦濤,陳素娟,彭大新,夏同海.  中國畜牧獸醫(yī). 2017(04)
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[8]口瘡病毒B2L蛋白的原核表達及間接ELISA檢測方法的建立[J]. 龐文靜,張琪,郭抗抗,何亞鵬,付明哲,許信剛.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2017(02)
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[10]抗羊口瘡病毒ORFV118蛋白單克隆抗體的制備、鑒定及其應(yīng)用[J]. 肖斌,郝文波,杜政倫,廖小青,羅樹紅.  病毒學(xué)報. 2016(03)

博士論文
[1]羊傳染性膿皰病毒FIL基因克隆表達及分子生物學(xué)檢測方法的建立與初步應(yīng)用[D]. 邵洪澤.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[2]羊傳染性膿皰病毒重組DNA疫苗的構(gòu)建與實驗免疫研究[D]. 趙魁.吉林大學(xué) 2010

碩士論文
[1]青島奧特奶山羊養(yǎng)殖場羊口瘡病原學(xué)調(diào)查及滅活疫苗免疫效果評估[D]. 李星明.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2018
[2]羊口瘡抗體間接ELISA方法的建立及血清學(xué)調(diào)查[D]. 王斌.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[3]羊口瘡病毒陜西株B2L基因的克隆表達及間接ELISA檢測方法的建立[D]. 何建斌.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2017
[4]羊口瘡病毒B2L和F1L基因的表達及其多克隆抗體的制備[D]. 李國華.海南大學(xué) 2017
[5]陜西白絨山羊和奶山羊羊口瘡病原調(diào)查及滅活疫苗免疫效果評估[D]. 李雯麗.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2016
[6]羊口瘡病毒和山羊痘病毒的分離鑒定及羊口瘡病毒B2L蛋白單克隆抗體的研制[D]. 朱相儒.揚州大學(xué) 2016
[7]羊口瘡抗體ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 李杰.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2013
[8]羊口瘡病毒的分離鑒定及其ELISA檢測方法的建立[D]. 張海瑞.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011



本文編號：3159447