發(fā)布時(shí)間：2021-04-22 06:36

　　口腔黏膜上皮細(xì)胞是機(jī)體重要的屏障,但也是許多病毒和細(xì)菌入侵機(jī)體的主要靶標(biāo)途徑。正常組織細(xì)胞壽命有限。原代豬口腔黏膜上皮細(xì)胞（porcine oral mucosal epithelial cells,POMECs）通常在經(jīng)過(guò)12次傳代之后衰老死亡。永生化細(xì)胞系可為病毒相關(guān)疾病的研究提供良好的體外細(xì)胞模型。豬圓環(huán)病毒2（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾�。╬orcine circovirus-associated diseases,PCADs）的主要病原,給國(guó)內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而,目前還沒有合適的細(xì)胞模型用于體外研究PCV2的致細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effects,CPE）,這嚴(yán)重制約了對(duì)PCV2致病機(jī)制的研究�？谔阋卟《荆‵oot-and-mouth disease virus,FMDV）侵襲易感動(dòng)物（特別是豬、牛、羊等偶蹄家畜）,以發(fā)熱、黏膜或者皮膚（尤其是口腔和蹄叉部位）出現(xiàn)水皰為主要特征,但是因缺乏合適的動(dòng)物細(xì)胞系,其致病機(jī)理的研究也受到了嚴(yán)重限制。本研究分離培養(yǎng)了原代POMECs,通過(guò)導(dǎo)入人端粒酶... 

【文章來(lái)源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：100 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    第一章 口腔黏膜上皮細(xì)胞研究進(jìn)展
        1.1 口腔黏膜的結(jié)構(gòu)和功能
        1.2 口腔黏膜上皮細(xì)胞和免疫
        1.3 口腔黏膜上皮細(xì)胞和疾病
        1.4 口腔黏膜上皮細(xì)胞的角蛋白表達(dá)特異性
            1.4.1 角蛋白的分子生物學(xué)
            1.4.2 角蛋白表達(dá)具有組織和細(xì)胞特異性
            1.4.3 口腔黏膜上皮細(xì)胞中角蛋白的表達(dá)
        1.5 口腔黏膜上皮細(xì)胞的分離
        1.6 口腔黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
            1.6.1 口腔黏膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法
            1.6.2 口腔黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)條件
            1.6.3 口腔黏膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)中的污染問題
            1.6.4 口腔黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境
        1.7 口腔黏膜上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性
            1.7.1 細(xì)胞鑒定
            1.7.2 克隆形成率
            1.7.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        1.8 口腔黏膜上皮細(xì)胞的組織工程應(yīng)用
        1.9 展望
    第二章 端粒及端粒酶與細(xì)胞永生化研究進(jìn)展
        2.1 端粒的結(jié)構(gòu)和功能
            2.1.1 端粒結(jié)構(gòu)
            2.1.2 端粒功能
        2.2 端粒酶的結(jié)構(gòu)和功能
        2.3 細(xì)胞的永生化
            2.3.1 端粒酶使細(xì)胞永生化機(jī)制
            2.3.2 端粒酶永生化細(xì)胞研究進(jìn)展
        2.4 衰老和癌癥的端粒-端粒酶理論
        2.5 展望
試驗(yàn)研究
    第三章 新生仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
        3.1 材料
            3.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物
            3.1.2 主要試劑
            3.1.3 主要儀器設(shè)備
        3.2 方法
            3.2.1 組織采集
            3.2.2 主要細(xì)胞培養(yǎng)液的配置
            3.2.3 仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)
            3.2.4 仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)
            3.2.5 仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞的純化
            3.2.6 仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞的觀察與鑒定
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 原代細(xì)胞的培養(yǎng)
            3.3.2 POMECs分離培養(yǎng)方法的比較
            3.3.3 仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
            3.3.4 仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征
            3.3.5 仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞鑒定
            3.3.6 仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
            3.3.7 仔豬口腔黏膜上皮細(xì)胞周期
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 hTERT介導(dǎo)的永生化豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的建立
        4.1 材料
            4.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和主要試劑
            4.1.2 主要儀器設(shè)備
        4.2 方法
            4.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)液的配置
            4.2.2 pCI-neo-hTERT質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染
            4.2.3 端粒酶活性檢測(cè)
            4.2.4 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中外源性hTERT基因的表達(dá)
            4.2.5 hTERT-POMECs的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
            4.2.6 細(xì)胞生長(zhǎng)周期檢測(cè)
            4.2.7 hTERT-POMECs細(xì)胞標(biāo)志分子的間接免疫熒光鑒定
            4.2.8 PCR檢測(cè)hTERT-POMECs中免疫相關(guān)基因的表達(dá)
            4.2.9 POMECs非顯帶染色體核型分析
            4.2.10 裸鼠致瘤性試驗(yàn)
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 pCI-neo-hTERT質(zhì)粒濃度和純度測(cè)定
            4.3.2 pCI-neo-hTERT質(zhì)粒鑒定
            4.3.3 POMECs G418最佳篩選濃度的確定
            4.3.4 pCI-neo-hTERT轉(zhuǎn)染后篩選永生化細(xì)胞系
            4.3.5 hTERT基因成功表達(dá)于hTERT-POMECs中
            4.3.6 hTERT-POMECs的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
            4.3.7 hTERT-POMECs的細(xì)胞生長(zhǎng)周期
            4.3.8 hTERT-POMECs的免疫熒光鑒定
            4.3.9 hTERT-POMECs具有原代POMECs的基本生物學(xué)功能
            4.3.10 hTERT-POMECs細(xì)胞核型分析
            4.3.11 hTERT-POMECs的致瘤性試驗(yàn)
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 自發(fā)永生化豬口腔黏膜上皮細(xì)胞系的篩選與鑒定
        5.1 材料
        5.2 方法
            5.2.1 Sp-POMECs的獲得
            5.2.2 Sp-POMECs的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
            5.2.3 Sp-POMECs細(xì)胞標(biāo)志分子的間接免疫熒光鑒定
            5.2.4 Sp-POMECs的核型分析和致瘤性分析
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 Sp-POMECs的生長(zhǎng)及其細(xì)胞形態(tài)
            5.3.2 Sp-POMECs的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
            5.3.3 Sp-POMECs的鑒定
            5.3.5 Sp-POMECs的核型分析
            5.3.6 Sp-POMECs的致瘤性分析
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
    第六章 豬圓環(huán)病毒2型和口蹄疫病毒在POMECs中的增殖特性
        6.1 材料
            6.1.1 毒株和細(xì)胞
            6.1.2 主要試劑
            6.1.3 主要儀器設(shè)備
        6.2 方法
            6.2.1 細(xì)胞準(zhǔn)備和病毒接種
            6.2.2 免疫熒光
            6.2.3 PCR檢測(cè)PCV2
            6.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
            6.2.5 TCID50滴定病毒滴度
            6.2.6 病毒的復(fù)制曲線
        6.3 結(jié)果
            6.3.1 PCV2感染致POMECs細(xì)胞病變
            6.3.2 免疫熒光和PCR鑒定PCV2感染POMECs
            6.3.3 PCV2感染POMECs的增殖特性
            6.3.4 FMDV感染致POMECs發(fā)生病變
            6.3.5 FMDV感染POMECs的免疫熒光鑒定
            6.3.6 FMDV感染POMECs的增殖特性
        6.4 討論
        6.5 小結(jié)
結(jié)論
本論文的創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
附錄
主要縮略詞和中英文對(duì)照表（Abbreviation Index）
致謝
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Development of cancer-initiating cells and immortalized cells with genomic instability[J]. Ken-ichi Yoshioka,Yuko Atsumi,Hitoshi Nakagama,Hirobumi Teraoka.  World Journal of Stem Cells. 2015(02)
[2]體外連續(xù)培養(yǎng)人口腔粘膜角化細(xì)胞(英文)[J]. 周曾同,周海文,商慶新,曹誼林.  Chinese Medical Journal. 2001(07)



本文編號(hào)：3153317