獸藥在畜牧業(yè)快速發(fā)展過程中發(fā)揮著不可替代的作用,四環(huán)素類藥物作為一類廣譜抗生素被廣泛用于治療動(dòng)物的多種感染性疾病。但此類藥物在動(dòng)物性食品中的殘留會(huì)給消費(fèi)者帶來一系列潛在的健康危害。本論文的目的是制備出四環(huán)素類藥物的受體TetR蛋白并對(duì)其進(jìn)行定向進(jìn)化,以其為識(shí)別元件建立新型免疫法對(duì)此類藥物在動(dòng)物性食品中的殘留進(jìn)行檢測(cè)。首先,研究者從四環(huán)素耐藥菌中提取總DNA,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出TetR蛋白的基因,將其插入表達(dá)載體并導(dǎo)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明,該TetR蛋白的分子量為44 KDa,能同時(shí)識(shí)別5種四環(huán)素類藥物,IC50為2.37-31 ng/mL。分子對(duì)接的結(jié)果表明,該受體的結(jié)合位點(diǎn)由12個(gè)氨基酸組成,它們主要通過疏水作用力和pi-pi鍵與藥物分子中的D環(huán)發(fā)生結(jié)合。以該TetR蛋白為核心試劑建立的競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光免疫法可以對(duì)牛奶中的這5種四環(huán)素類藥物進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)限為1.24-15.7 ng/mL,添加回收率為77-96%。然后,研究者對(duì)TetR蛋白中的關(guān)鍵接觸氨基酸分別進(jìn)行了虛擬突變。結(jié)果表明,將105位脯氨酸突變?yōu)楸奖彼岷屠野彼釙r(shí),受體的穩(wěn)定性明顯提升。于是研究... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 四環(huán)素類藥物概述
        1.1.1 理化性質(zhì)
        1.1.2 作用機(jī)制
        1.1.3 藥物殘留及其危害
    1.2 四環(huán)素類藥物殘留檢測(cè)方法現(xiàn)狀
        1.2.1 微生物法
        1.2.2 理化檢測(cè)法
        1.2.3 免疫分析方法
        1.2.4 其它
    1.3 受體
        1.3.1 受體免疫分析法
        1.3.2 受體免疫分析法應(yīng)用于獸藥殘留檢測(cè)
        1.3.3 TetR蛋白
    1.4 分子對(duì)接及定向進(jìn)化
        1.4.1 受體空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
        1.4.2 分子對(duì)接
        1.4.3 定點(diǎn)突變技術(shù)
    1.5 研究目的和意義
2 材料與方法
    2.1 試驗(yàn)材料
        2.1.1 藥品與試劑
        2.1.2 所用儀器
        2.1.3 所用溶液
        2.1.4 所用軟件
    2.2 TetR受體的制備及鑒定
        2.2.1 合成引物
        2.2.2 四環(huán)素耐藥菌復(fù)蘇
        2.2.3 TetR基因的擴(kuò)增和純化
        2.2.4 酶切載體及基因
        2.2.5 目的片段與重組載體連接及轉(zhuǎn)化
        2.2.6 TetR受體的原核表達(dá)
        2.2.7 TetR受體的純化
        2.2.8 TetR受體的鑒定
        2.2.9 添加回收實(shí)驗(yàn)
    2.3 TetR受體的體外進(jìn)化
        2.3.1 序列對(duì)比
        2.3.2 同源建模
        2.3.3 分子對(duì)接
        2.3.4 構(gòu)建TetR突變體模型
        2.3.5 TetR突變體分子對(duì)接
        2.3.6 合成突變體引物
        2.3.7 定點(diǎn)突變
        2.3.8 突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
        2.3.9 誘導(dǎo)TetR突變體表達(dá)
        2.3.10 TetR突變體純化
        2.3.11 TetR突變體的鑒定
    2.4 固相分散微萃取結(jié)合超高效液相（MOF-MIP-DSPME-UPLC）方法的建立
        2.4.1 金屬-有機(jī)框架材料（MOF）的制備
        2.4.2 MOF-MIP的制備及檢驗(yàn)
        2.4.3 UPLC條件
        2.4.4 添加回收實(shí)驗(yàn)
3 結(jié)果與分析
    3.1 TetR受體的制備
        3.1.1 TetR基因
        3.1.2 重組表達(dá)載體
        3.1.3 TetR受體誘導(dǎo)表達(dá)
        3.1.4 TetR受體純化
        3.1.5 建立化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)牛奶中四環(huán)素藥物殘留
        3.1.6 樣品檢測(cè)
    3.2 同源建模及體外進(jìn)化
        3.2.1 序列對(duì)比
        3.2.2 同源建模
        3.2.3 分子對(duì)接
        3.2.4 構(gòu)建突變體模型
        3.2.5 突變體分子對(duì)接
        3.2.6 定點(diǎn)突變及突變體基因
        3.2.7 TetR突變體的表達(dá)及純化
        3.2.8 建立競(jìng)爭(zhēng)熒光免疫法檢測(cè)雞蛋中四環(huán)素藥物殘留
        3.2.9 樣品提取及添加回收
    3.3 MOF-MIP- DSPME-UPLC方法的建立及應(yīng)用
        3.3.1 MOF和MOF-MIP的檢驗(yàn)
        3.3.2 MOF-MIP的性能
        3.3.3 樣品檢測(cè)
4 討論
    4.1 TetR受體的分子識(shí)別機(jī)制
    4.2 體外進(jìn)化
        4.2.1 分子對(duì)接
        4.2.2 定點(diǎn)突變
    4.3 相關(guān)方法的比較
    4.4 展望
5 結(jié)論
    5.1 成功制備出了四環(huán)素類藥物的受體TetR蛋白
    5.2 成功對(duì)TetR蛋白進(jìn)行了體外定向進(jìn)化
    5.3 建立了MOF-MIP-DSPME-UPLC法
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表論文
作者簡介
致謝
附錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[9]吩噻嗪類藥物單鏈抗體的制備及進(jìn)化[D]. 史芳舒.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
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本文編號(hào)：3152058