發(fā)布時間：2021-04-21 14:06

　　脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON）是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素。DON是一種全球性的谷物污染物,可引起人和動物的急性中毒,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究資料顯示,單端孢霉烯毒素的12,13環(huán)氧環(huán)是主要的致毒基團(tuán),此環(huán)一旦遭到破壞,可以大大減少毒性。環(huán)氧化物水解酶（Epoxide hydrolase, EH）在催化反應(yīng)中能顯示出高的對映立體選擇性,水解環(huán)氧化合物生成光學(xué)活性環(huán)氧化物和相應(yīng)的1,2-二醇。研究發(fā)現(xiàn),瘤胃及土壤中的一些微生物可以產(chǎn)生環(huán)氧化物水解酶,通過分解單端孢霉烯族毒素分子中的環(huán)氧基團(tuán),從而降低毒性。本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離獲得一株NJA-1菌株,可以水解DON的環(huán)氧環(huán)。研究結(jié)果顯示NJA-1菌中對DON的轉(zhuǎn)化起到關(guān)鍵作用的是環(huán)氧化物水解酶。本試驗(yàn)在以前試驗(yàn)基礎(chǔ)上,將已獲得的DON降解酶基因與真核表達(dá)載體pPIC9K重組,構(gòu)建pPIC9K-EHsq真核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115菌,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),利用高效液相色譜（HPLC）法研究表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DON的效果,從而證實(shí)該酶對DON具有轉(zhuǎn)化作用。為該酶... 

【文章來源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
符號及縮略語
第一篇 文獻(xiàn)綜述
    第一章 環(huán)氧化物水解酶（EH）的研究進(jìn)展
        1 EH概述
        2 EH結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能
            2.1 EH的結(jié)構(gòu)
            2.2 EH的生物功能
        3 EH的催化機(jī)制
        4 EH的應(yīng)用前景
        參考文獻(xiàn)
    第二章 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展
        1 畢赤酵母概述
        2 畢赤酵母生物學(xué)特性
        3 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的組成
            3.1 宿主菌株
            3.2 表達(dá)載體
            3.3 表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化及與畢赤酵母的整合
        4 外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)
            4.1 外源蛋白的表達(dá)方式
            4.2 表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后加工、修飾
        5 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用
        參考文獻(xiàn)
第二篇 試驗(yàn)部分
    第三章 NJA-1菌中DON降解酶基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)
        摘要
        1 材料
            1.1 菌種和質(zhì)粒
            1.2 主要酶與試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 原核表達(dá)載體菌pET32a（+）-EHse/BL21的活化及擴(kuò)增培養(yǎng)
            2.2 pET32a（+）-EHse質(zhì)粒的提取
            2.3 引物設(shè)計(jì)
            2.4 EH基因的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定
            2.5 PCR產(chǎn)物的回收與純化
            2.6 pMD-EHsq克隆載體的構(gòu)建
            2.7 重組質(zhì)粒pPIC9K-EHsq的構(gòu)建
            2.8 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母
            2.9 重組酵母的篩選
            2.10 pEH蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.11 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳
        3 結(jié)果
            3.1 EH基因的PCR結(jié)果分析
            3.2 pMD-EHsq及pPIC9K大腸桿菌陽性克隆的篩選與鑒定
            3.3 重組質(zhì)粒pMD-EHsq及真核載體質(zhì)粒pPIC9K雙酶切結(jié)果分析
            3.4 重組表達(dá)載體pPIC9K-EHsq鑒定結(jié)果分析
            3.5 轉(zhuǎn)化GS115重組子的篩選和鑒定
            3.6 重組蛋白在GS115中的表達(dá)結(jié)果
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
        英文摘要
    第四章 PEH蛋白轉(zhuǎn)化DON效果的檢測及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化
        摘要
        1 材料
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 pEH蛋白轉(zhuǎn)化DON效果的檢測（高效液相色譜法）
            2.2 pEH蛋白轉(zhuǎn)化DON條件的優(yōu)化
        3 結(jié)果
            3.1 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
            3.2 HPLC檢測樣品DON濃度
            3.3 初酶液對DON轉(zhuǎn)化率的測定
            3.4 不同破壁方式條件下初酶液轉(zhuǎn)化DON效果的比較
            3.5 不同溫度條件下初酶液轉(zhuǎn)化DON效果的比較
            3.6 金屬離子對轉(zhuǎn)化DON效果的影響
        4 討論
        參考文獻(xiàn)
        英文摘要
全文總結(jié)
附錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因的克隆及在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J]. 劉海燕,孫長坡,伍松陵,張艷菊,吳子丹.  中國糧油學(xué)報(bào). 2011(05)
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[4]巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在動物傳染病防制中應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 孫靜,孫惠玲,張培君.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2008(05)
[5]豬γ-干擾素在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及其抗病毒作用[J]. 姚清俠,黃勤鋒,曹毅,司有輝,錢平,陳煥春.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(04)
[6]畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)及其在水產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用[J]. 郭小澤.  內(nèi)陸水產(chǎn). 2008(02)
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[8]巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)及其在飼料添加劑開發(fā)上的應(yīng)用前景[J]. 許英蕾,孫建義,劉明啟.  飼料工業(yè). 2005(02)
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博士論文
[1]小麥赤霉病菌DON毒素及其降解基因Tri101的克隆和遺傳轉(zhuǎn)化研究[D]. 閆海霞.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010

碩士論文
[1]NJA-1菌中DON降解酶基因的克隆、表達(dá)及特性研究[D]. 皇超英.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[2]環(huán)氧化物水解酶產(chǎn)生菌的篩選及其發(fā)酵條件和對苯基縮水甘油醚類化合物拆分條件的研究[D]. 盛艷旻.浙江工業(yè)大學(xué) 2010
[3]NJA-1菌產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶條件的優(yōu)化及對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇生物轉(zhuǎn)化的研究[D]. 趙俊廷.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[4]環(huán)氧化物水解酶序列識別和分類模型的構(gòu)建[D]. 賈佳.浙江大學(xué) 2006



本文編號：3151898