為了構(gòu)建敖漢細(xì)毛羊Hoxa7基因表達(dá)載體以及研究表達(dá)載體轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后基因表達(dá)量的變化,試驗(yàn)從40日齡敖漢細(xì)毛羊肩部皮膚提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,參照GenBank中Hoxa7基因的CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物;將PCR擴(kuò)增獲取的Hoxa7基因CDS片段連接到pEASYTM-T1載體上,構(gòu)建pEASYTM-T1-Hoxa7克隆載體,將克隆載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中;從pEASYTM-T1載體上切下Hoxa7基因片段,連接到pcDNA3.1表達(dá)載體上,再次轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中;將重組表達(dá)載體pcDNA3.1-Hoxa7瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到傳代的成纖維細(xì)胞中,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、Western-blot方法檢測(cè)成纖維細(xì)胞中Hoxa7基因的mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明:重組表達(dá)載體pcDNA3.1-Hoxa7構(gòu)建成功;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到成纖維細(xì)胞中后, Hoxa7基因的mRNA和蛋白表達(dá)量均極顯著升高（P<0.01）。說(shuō)明敖漢細(xì)毛羊Hoxa7基因在成纖維細(xì)胞中能夠高效表達(dá)。 

【文章來(lái)源】：黑龍江畜牧獸醫(yī). 2020,(11)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：7 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料
    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
    1.2 主要試劑
    1.3 主要儀器
2 方法
    2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
    2.2 目的基因的PCR擴(kuò)增
    2.3 TA克隆測(cè)序
    2.4 Hoxa7基因與pcDNA3.1表達(dá)載體重組
    2.5 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
    2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增
    2.7 Hoxa7基因編碼蛋白的檢測(cè)
    2.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 Hoxa7基因的PCR擴(kuò)增
    3.2 TA克隆測(cè)序
    3.3 Hoxa7基因與pcDNA3.1表達(dá)載體重組
        3.3.1 克隆載體的鑒定及提取
        3.3.2 克隆載體及pcDNA3.1表達(dá)載體雙酶切
        3.3.3 pcDNA3.1表達(dá)載體與Hoxa7基因的連接鑒定
        3.3.4 重組表達(dá)載體菌液的測(cè)序
    3.4 成纖維細(xì)胞觀察
        3.4.1 原代細(xì)胞觀察
        3.4.2 傳代細(xì)胞觀察
    3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增
    3.6 Hoxa7基因編碼蛋白的檢測(cè)
4 討論
5 結(jié)論


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]敖漢細(xì)毛羊Hoxa5基因質(zhì)粒的構(gòu)建及在成纖維細(xì)胞中表達(dá)量的研究[J]. 張夢(mèng)瑤,楊峰,劉開(kāi)東,劉積鳳,柳楠,賀建寧.  中國(guó)獸醫(yī)雜志. 2018(10)
[2]HOXA7在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 陳浩,段曉峰,樸正國(guó),歐陽(yáng)可雄,Muy-Teck Teh,馬洪.  貴州醫(yī)藥. 2017(09)
[3]BMPR1B基因在細(xì)毛羊皮膚毛囊中的表達(dá)及與羊毛性狀關(guān)系的研究[J]. 王小佳,賀建寧,程明,劉開(kāi)東,劉積鳳,柳楠.  中國(guó)畜牧雜志. 2017(01)
[4]皮膚毛囊發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展[J]. 江瑋,范一星,喬賢,張燕軍,劉志紅,趙艷紅,王瑞軍,王志新,張文廣,蘇蕊,李金泉.  遺傳. 2015(06)
[5]Hox基因家族對(duì)細(xì)毛羊羊毛性狀影響的研究[J]. 柳楠,卜然,賀建寧,程明,劉開(kāi)東,劉積鳳,趙金山.  中國(guó)畜牧雜志. 2014(23)
[6]RNA干擾抑制HOXA7表達(dá)能逆轉(zhuǎn)白血病U937細(xì)胞多藥耐藥[J]. 尹寶慧,賈秀紅,李建廠(chǎng).  腫瘤. 2013(07)
[7]哺乳動(dòng)物毛囊結(jié)構(gòu)特征及調(diào)控機(jī)制[J]. 馬馨,陳洋,姜懷志.  中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué). 2013(01)
[8]內(nèi)蒙古絨山羊Hoxa7基因在毛囊中的表達(dá)[J]. 張燕軍,李金泉,尹俊,高愛(ài)琴,張文廣,趙艷紅.  湖北農(nóng)業(yè)科學(xué). 2010(03)
[9]敖漢細(xì)毛羊[J]. 宗澤君,孫德欣.  農(nóng)村養(yǎng)殖技術(shù). 2004(20)
[10]敖漢細(xì)毛羊品種形成與發(fā)展前景[J]. 劉海山,李恒榮,于洪杰,劉俊茹,張富.  當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè). 2001(08)

博士論文
[1]影響綿羊毛纖維與毛囊結(jié)構(gòu)及生產(chǎn)性狀的分子機(jī)理研究[D]. 李樹(shù)偉.吉林大學(xué) 2008



本文編號(hào)：3151114