牛結(jié)核�。˙ovine tuberculosis）是由牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis, Mb）引起的一種慢性人獸共患傳染病,給畜牧業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生帶來了嚴(yán)重危害。Mb成功侵入巨噬細(xì)胞并在其胞內(nèi)存活是其致病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。因此,解析與細(xì)胞入侵相關(guān)的蛋白的功能將有助于控制牛結(jié)核病。牛分枝桿菌Mb1514基因編碼一種推定侵入蛋白（本研究將其命名MbINV蛋白）,但其確切功能尚不明確。本研究利用基因重組技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行了克隆、原核表達(dá)、純化和復(fù)性,首次成功獲得了重組蛋白,并利用鼠巨噬細(xì)胞模型RAW264.7初步解析了該蛋白的生物功能。為更深入地研究該基因的功能和在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中的作用,成功構(gòu)建了該基因的綠色熒光融合蛋白穿梭表達(dá)載體,并將其電轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌后獲得了重組菌株。具體研究?jī)?nèi)容如下：1.以Mb的DNA為模板,PCR擴(kuò)增Mb1514基因并將其克隆至pEASY-T1載體。測(cè)序結(jié)果表明,克隆所得基因與GenBank上所公布的M. bovis AF2122/97的Mb1514基因序列100%同源。將該基因插入到原核表達(dá)載體pET-28a（+）中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
目錄
插圖和附表清單
英文縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 牛結(jié)核病病原學(xué)研究
        1.1.1 牛結(jié)核病病原學(xué)
        1.1.2 病原基因組學(xué)研究
    1.2 牛結(jié)核病的發(fā)生與流行情況
        1.2.1 國(guó)外牛結(jié)核病的流行情況
        1.2.2 我國(guó)牛結(jié)核病的流行情況
    1.3 牛結(jié)核病的控制策略
    1.4 結(jié)核病致病機(jī)制的研究進(jìn)展
        1.4.1 結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞的生物學(xué)過程
        1.4.2 結(jié)核分枝桿菌感染與細(xì)胞因子調(diào)控
    1.5 Mb1514基因的研究進(jìn)展
    1.6 本課題的研究意義
第二章 Mb1514基因的原核表達(dá)與純化
    引言
    2.1 材料
        2.1.1 牛分枝桿菌菌株
        2.1.2 宿主菌株和質(zhì)粒
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)所用溶液及配制
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
        2.1.6 數(shù)據(jù)分析軟件
    2.2 方法
        2.2.1 牛分枝桿菌的培養(yǎng)
        2.2.2 細(xì)菌基因組的提取
        2.2.3 引物設(shè)計(jì)
        2.2.4 Mb1514基因的克隆
        2.2.5 Mb1514原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.6 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
        2.2.7 SDS-PAGE分析
        2.2.8 包涵體蛋白的純化和復(fù)性
        2.2.9 重組蛋白的Western blotting檢測(cè)
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 Mb1514基因的PCR擴(kuò)增和陽性克隆的篩選
        2.3.2 Mb1514基因序列分析
        2.3.3 Mb1514基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.4 MbINV重組蛋白的SDS-PAGE分析與純化
        2.3.5 重組蛋白的Western blotting鑒定
    2.4 討論與小結(jié)
第三章 重組蛋白MbINV與巨噬細(xì)胞相互作用的研究
    引言
    3.1 材料
        3.1.1 細(xì)胞
        3.1.2 宿主菌和載體
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)所用溶液及其配制
        3.1.5 主要儀器與設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng)
        3.2.2 重組蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響（CCK-8法）
        3.2.3 重組蛋白引起的巨噬細(xì)胞死亡方式的測(cè)定
        3.2.4 重組蛋白刺激巨噬細(xì)胞后對(duì)促炎細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的影響
        3.2.5 重組蛋白細(xì)胞侵入功能的測(cè)定
        3.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 重組蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響
        3.3.2 重組蛋白引起的巨噬細(xì)胞死亡方式的檢測(cè)
        3.3.3 促炎細(xì)胞因子熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.3.4 重組蛋白刺激巨噬細(xì)胞后促炎因子mRNA表達(dá)量的變化
        3.3.5 重組蛋白細(xì)胞侵入功能的測(cè)定
    3.4 討論與小結(jié)
第四章 MbINV綠色熒光融合蛋白穿梭表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和重組恥垢分枝桿菌的篩選
    引言
    4.1 材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 宿主菌和質(zhì)粒
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)所用溶液及配制
        4.1.5 主要儀器設(shè)備
        4.1.6 分析工具軟件
    4.2 方法
        4.2.1 引物設(shè)計(jì)
        4.2.2 EGFP基因的擴(kuò)增和穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.3 Mb1514基因的擴(kuò)增和Mb1514-EGFP-pLAM12的構(gòu)建
        4.2.4 Mb1514-EGFP-pLAM12重組恥垢分枝桿菌的篩選
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 EGFP基因的PCR擴(kuò)增
        4.3.2 EGFP-pLAM12重組質(zhì)粒的PCR鑒定
        4.3.3 EGFP序列分析
        4.3.4 EGFP重組恥垢分枝桿菌的篩選和鑒定
        4.3.5 Mb1514基因的PCR擴(kuò)增
        4.3.6 Mb1514-EGFP-pLAM12重組穿梭表達(dá)載體的酶切鑒定和測(cè)序
        4.3.7 重組恥垢分枝桿菌的篩選
    4.4 討論與小結(jié)
結(jié)論
創(chuàng)新
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
個(gè)人簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]牛結(jié)核病流行特點(diǎn)及防控措施[J]. 郭愛珍,陳煥春.  中國(guó)奶牛. 2010(11)
[2]結(jié)核病的化學(xué)治療及面臨的挑戰(zhàn)[J]. 馬玙.  中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào). 2009(04)
[3]陜西省關(guān)中地區(qū)奶牛結(jié)核病調(diào)查[J]. 段旭基,張鵬,王波,張淑霞,黨如意,楊增岐.  中國(guó)動(dòng)物檢疫. 2009(07)
[4]奶牛結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查研究[J]. 郭開彬.  草業(yè)與畜牧. 2008(12)
[5]牛分枝桿菌MPB51基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J]. 姜秀云,王春鳳,王春芳,何昭陽.  微生物學(xué)報(bào). 2005(02)



本文編號(hào)：3150150