1.鴨腸炎病毒UL18基因的序列特征與密碼子使用偏愛性運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)注冊(cè)的鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus,DEV） UL18基因（GenBank登錄號(hào)為EU195093）及其編碼蛋白進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,DEVUL18基因大小969bp,編碼蛋白為一條含322個(gè)氨基酸殘基組成的多肽,相對(duì)分子量為35.250KD,等電點(diǎn)理論值為8.37,無信號(hào)肽切割位點(diǎn),含有15個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)N-糖基化位點(diǎn),含15個(gè)潛在的B細(xì)胞表位；系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,DEVUL18屬于α-皰疹病毒的一個(gè)成員,與MeHV-1的親緣關(guān)系最近；密碼子偏愛性分析結(jié)果表明,若要對(duì)DEVUL18基因進(jìn)行外源表達(dá),真核表達(dá)系統(tǒng)可能更容易。若選擇原核表達(dá)系統(tǒng),則需要對(duì)宿主表達(dá)菌進(jìn)行選擇和條件優(yōu)化,才能有利于該基因在體外表達(dá)重組蛋白。2.鴨腸炎病毒UL18基因的原核表達(dá)、抗體制備及應(yīng)用根據(jù)注冊(cè)的DEV UL18基因序列,用Primer Premier6.0軟件設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性擴(kuò)增DEVUL18基因的引物。用該引物從DEV基因組中擴(kuò)增UL18基因,并將其正向插入pET32a（+）原核表達(dá)質(zhì)粒... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
本論文的創(chuàng)新性工作
中文摘要
ABSTRACT
常用英文縮寫詞匯
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 皰疹病毒UL18基因及其編碼蛋白的研究進(jìn)展
        1 皰疹病毒UL18基因序列特點(diǎn)
        2 皰疹病毒UL18編碼蛋白特點(diǎn)
        3 UL18蛋白的作用
            3.1 VP23與核衣殼的形成
            3.2 VP23對(duì)衣殼關(guān)閉的作用
            3.3 VP23對(duì)病毒毒力的影響
            3.4 UL18蛋白限制NK細(xì)胞介導(dǎo)殺傷作用
        4 UL18蛋白的定位
        5 展望
第二部分 實(shí)驗(yàn)研究
    第二章 鴨腸炎病毒UL18基因的序列特征及密碼子偏愛性分析
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 基因文庫
                1.1.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
                1.1.3 主要生物信息學(xué)分析軟件
            1.2 方法
                1.2.1 DEV UL18基因核酸序列的分子特性分析
                1.2.2 DEV UL18基因編碼蛋白序列的分子特性分析
                1.2.3 DEV UL18基因的密碼子偏愛性分析
        2 結(jié)果
            2.1 DEV UL18基因核酸序列的分子特征
            2.2 DEV UL18基因編碼蛋白序列的分子特征
                2.2.1 DEV UL18基因編碼蛋白的氨基酸組成分析
                2.2.2 DEV UL18基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域
                2.2.3 DEV UL18基因編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹
                2.2.4 DEV UL18基因編碼蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)
                2.2.5 DEV UL18基因編碼蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
                2.2.6 DEV UL18基因編碼蛋白糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
                2.2.7 DEV UL18基因編碼蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)
                2.2.8 DEV UL18基因編碼蛋白疏水性分析
                2.2.9 DEV UL18基因編碼蛋白抗原性分析
                2.2.10 DEV UL18基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析
                2.2.11 DEV UL18基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位
            2.3 DEV UL18基因的密碼子偏愛性
                2.3.1 DEV UL18基因與27種皰疹病毒UL18基因密碼子使用偏愛性分析
                2.3.2 DEV UL18基因密碼子使用和氨基酸組成的偏愛性分析
                2.3.3 DEV UL18基因密碼子使用與人、酵母和大腸桿菌密碼子使用偏愛性比較
        3 討論
            3.1 DEV UL18基因的分子特性
            3.2 DEV UL18基因編碼蛋白的抗原性
            3.3 DEV UL18編碼蛋白與其它皰疹病毒UL18蛋白間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系
            3.4 DEV UL18基因的密碼子偏愛性
        4 小結(jié)
        Abstract
    第三章 鴨腸炎病毒UL18基因的原核表達(dá)、抗體制備及應(yīng)用
        摘要
        1 材料
            1.1 菌株、毒株和質(zhì)粒
            1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.3 主要試劑及其配制
                1.3.1 主要試劑
                1.3.2 主要試劑配制
            1.4 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 DEV UL18基因的克隆
                2.1.1 引物設(shè)計(jì)
                2.1.2 DNA的提取
                2.1.3 PCR擴(kuò)增DEV UL18基因
                2.1.4 DEV UL18基因的PCR產(chǎn)物回收
                2.1.5 DEV UL18基因的T-載體克隆與鑒定
            2.2 DEV UL18基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.2.1 pMD18-T-UL18與表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）的提取、酶切與回收
                2.2.2 構(gòu)建重組表達(dá)菌株
            2.3 DEV UL18重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及條件優(yōu)化
                2.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-UL18的誘導(dǎo)表達(dá)
                2.3.2 重組質(zhì)粒pET32a-UL18誘導(dǎo)條件優(yōu)化
            2.4 DEV UL18重組蛋白的純化
                2.4.1 重組表達(dá)蛋白的可溶性分析
                2.4.2 重組質(zhì)粒pET32a-UL18大量誘導(dǎo)表達(dá)
                2.4.3 重組蛋白的純化
                2.4.4 重組蛋白的復(fù)性
                2.4.5 Western Blotting檢測(cè)
            2.5 兔抗DEV UL18重組蛋白抗體的制備及純化
                2.5.1 兔抗重組蛋白高免血清的制備
                2.5.2 免抗DEV UL18重組蛋白效價(jià)測(cè)定
                2.5.3 兔抗重組蛋白高免血清IgG的純化及鑒定
            2.6 基于DEV UL18重組蛋白間接ELISA法檢測(cè)DEV抗體的應(yīng)用
                2.6.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定
                2.6.2 最佳酶標(biāo)二抗工作濃度的確定
                2.6.3 DEV-UL18-ELISA方法臨界值的確定
                2.6.4 特異性試驗(yàn)
                2.6.5 敏感性試驗(yàn)
                2.6.6 重復(fù)性試驗(yàn)
            2.7 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫組化法檢測(cè)DEV感染鴨組織的應(yīng)用
                2.7.1 組織樣品的采集與處理
                2.7.2 間接免疫酶組化檢測(cè)DEV UL18蛋白方法的建立
                2.7.3 間接免疫酶組化檢測(cè)DEV UL18蛋白方法的優(yōu)化
                2.7.4 特異性實(shí)驗(yàn)
                2.7.5 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
                2.7.6 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫組化法對(duì)DEV感染鴨組織的檢測(cè)
            2.8 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法檢測(cè)DEV感染鴨組織的應(yīng)用
                2.8.1 組織樣品的采集與處理
                2.8.2 間接免疫熒光檢測(cè)DEV UL18蛋白方法的建立
                2.8.3 間接免疫熒光檢測(cè)DEV感染鴨組織UL18蛋白方法的優(yōu)化
                2.8.4 特異性實(shí)驗(yàn)
                2.8.5 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
                2.8.6 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法對(duì)DEV感染鴨組織的檢測(cè)
            2.9 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法檢測(cè)DEV感染宿主細(xì)胞的應(yīng)用
                2.9.1 免疫熒光檢測(cè)DEV感染宿主細(xì)胞方法的建立
                2.9.2 免疫熒光檢測(cè)DEV感染宿主細(xì)胞條件的優(yōu)化
                2.9.3 免疫熒光特異性檢測(cè)
                2.9.4 間接免疫熒光檢測(cè)的結(jié)果判定
                2.9.5 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法對(duì)DEV感染宿主細(xì)胞的檢測(cè)
        3 結(jié)果
            3.1 DEV UL18基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果
            3.2 DEV UL18基因的T-克隆鑒定結(jié)果
            3.3 原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-UL18的構(gòu)建及鑒定結(jié)果
            3.4 重組質(zhì)粒pET32a-UL18的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果
            3.5 重組質(zhì)粒pET32a-UL18的誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果
                3.5.1 表達(dá)宿主菌優(yōu)化
                3.5.2 溫度條件優(yōu)化
                3.5.3 時(shí)間條件優(yōu)化
                3.5.4 IPTG濃度優(yōu)化
            3.6 重組蛋白pET32a/DEV-UL18的純化結(jié)果
                3.6.1 重組表達(dá)蛋白的可溶性分析
                3.6.2 重組蛋白的大量純化
            3.7 兔抗重組蛋白pET32a/DEV-UL18抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果
            3.8 兔抗重組蛋白pET32a/DEV-UL18抗體IgG的純化結(jié)果
            3.9 Western Blotting檢測(cè)結(jié)果
            3.10 基于DEV UL18重組蛋白間接ELISA法檢測(cè)DEV抗體的應(yīng)用
                3.10.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度
                3.10.2 最佳酶標(biāo)二抗工作濃度
                3.10.3 ELISA陰陽性臨界值的判定標(biāo)準(zhǔn)
                3.10.4 特異性試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果
                3.10.5 敏感性試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果
                3.10.6 重復(fù)性試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果
            3.11 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫組化的應(yīng)用
                3.11.1 間接免疫酶組化檢測(cè)DEV感染鴨的組織切片優(yōu)化結(jié)果
                3.11.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果
                3.11.3 間接免疫酶組化法檢測(cè)DEV感染鴨組織切片結(jié)果
            3.12 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光檢測(cè)DEV感染組織的應(yīng)用
                3.12.1 間接免疫熒光檢測(cè)DEV感染鴨組織方法的優(yōu)化
                3.12.2 特異性試驗(yàn)
                3.12.3 間接免疫熒光法檢測(cè)DEV感染鴨組織的結(jié)果
            3.13 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光檢測(cè)DEV感染宿主細(xì)胞的應(yīng)用
                3.13.1 間接免疫熒光法檢測(cè)DEV感染宿主細(xì)胞飛片條件優(yōu)化結(jié)果
                3.13.2 特異性試驗(yàn)
                3.13.3 間接免疫熒光檢測(cè)DEV感染宿主細(xì)胞飛片結(jié)果
        4 討論
            4.1 DEV UL18基因的引物設(shè)計(jì)和克隆測(cè)序
            4.2 DEV UL18基因的克隆測(cè)序和表達(dá)載體的選擇
            4.3 皰疹病毒UL18基因的表達(dá)
            4.4 兔抗重組蛋白pET32a/DEV-UL18抗體IgG的制備和純化
            4.5 基于DEV UL18重組蛋白間接ELISA法檢測(cè)DEV抗體方法的應(yīng)用
            4.6 基于兔抗DEV UL18重組蛋白抗體介導(dǎo)的免疫酶組化和免疫熒光法檢測(cè)UL18蛋白的應(yīng)用
                4.6.1 免疫酶組化檢測(cè)DEV UL18蛋白在組織分布方法的建立及應(yīng)用
                4.6.2 免疫熒光法檢測(cè)DEV UL18蛋白在組織分布方法的建立及應(yīng)用
                4.6.3 間接免疫熒光與間接免疫酶組化檢測(cè)DEV UL18蛋白在感染鴨體內(nèi)分布比較
            4.7 基于免抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法檢測(cè)UL18蛋白細(xì)胞定位
                4.7.1 關(guān)于蛋白在細(xì)胞內(nèi)定位的檢測(cè)方法
                4.7.2 皰疹病毒DEV UL18蛋白的細(xì)胞定位與其功能的關(guān)系
        5 小結(jié)
        Abstract
    第四章 鴨腸炎病毒UL18基因在感染宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)特征
        摘要
        1 材料
            1.1 菌株、毒株和抗體
            1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.3 主要試劑及其配制
                1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑
                1.3.2 Western blotting檢測(cè)相關(guān)試劑
            1.4 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 熒光定量RT-PCR檢測(cè)DEV UL18基因在感染宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄時(shí)相
                2.1.1 熒光定量PCR引物的設(shè)計(jì)、合成及特異性檢測(cè)
                2.1.2 鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）的培養(yǎng)
                2.1.3 DEV病毒的增值
                2.1.4 總RNA的提取
                2.1.5 DNA的去除
                2.1.6 RNA完整性及純度檢測(cè)
                2.1.7 反轉(zhuǎn)錄
                2.1.8 目的片段的PCR擴(kuò)增及回收
                2.1.9 熒光定量PCR
                2.1.10 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
                2.1.11 數(shù)據(jù)處理與分析
            2.2 Western blotting檢測(cè)DEV UL18在感染宿主細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)相
                2.2.1 鴨胚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
                2.2.2 DEV病毒的增殖及采樣
                2.2.3 SDS-PAGE電泳
                2.2.4 Western blotting檢測(cè)
        3 結(jié)果
            3.1 DEV UL18基因在感染宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄時(shí)相結(jié)果
                3.1.1 熒光定量PCR引物特異性檢測(cè)
                3.1.2 RNA完整性及純度檢測(cè)
                3.1.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線
                3.1.4 DEV UL18基因在宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄特征
            3.2 DEV UL18基因在感染宿主細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)相結(jié)果
        4 討論
            4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)DEV UL18基因在DEF細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄時(shí)相方法的選擇
            4.2 DEV UL18基因的轉(zhuǎn)錄特征分析
            4.3 DEV UL18基因的表達(dá)特征分析
        5 小結(jié)
        Abstract
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介


【參考文獻(xiàn)】：
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[1]鴨瘟病毒UL51基因在COS-7細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)[J]. 沈嬋娟,程安春,汪銘書,郭宇飛,信洪一,徐超,賈仁勇,韓新峰.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2009(10)
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[5]鴨瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表達(dá)及在病毒感染宿主亞細(xì)胞中的定位分析[J]. 招麗嬋,程安春,汪銘書,袁桂萍,賈仁勇,周登春,葛菡,孫濤,陳孝躍.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(08)
[6]間接免疫熒光染色檢測(cè)石蠟切片中的鴨病毒性腸炎病毒和抗原定位[J]. 程安春,韓曉英,朱德康,汪銘書,袁桂萍,廖永洪,徐超.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(08)
[7]免疫組織化學(xué)技術(shù)在獸醫(yī)診斷中的應(yīng)用[J]. 萬美梅,孫彥偉,林乃鋒.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2008(06)
[8]偽狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表達(dá)[J]. 薛念波,肖少波,江云波,常天明,劉曼莉,趙騫,羅銳,陳煥春,方六榮.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(04)
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博士論文
[1]偽狂犬病病毒上海株gE～-/gI～-/GFP～+/LacZ～+缺失株的構(gòu)建及其免疫原性初步研究[D]. 姜焱.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2002

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本文編號(hào)：3143977