1.鴨腸炎病毒UL18基因的序列特征與密碼子使用偏愛性運用生物信息學(xué)分析軟件對注冊的鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus,DEV） UL18基因（GenBank登錄號為EU195093）及其編碼蛋白進行了分析。結(jié)果表明,DEVUL18基因大小969bp,編碼蛋白為一條含322個氨基酸殘基組成的多肽,相對分子量為35.250KD,等電點理論值為8.37,無信號肽切割位點,含有15個潛在的磷酸化位點和2個N-糖基化位點,含15個潛在的B細胞表位；系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明,DEVUL18屬于α-皰疹病毒的一個成員,與MeHV-1的親緣關(guān)系最近；密碼子偏愛性分析結(jié)果表明,若要對DEVUL18基因進行外源表達,真核表達系統(tǒng)可能更容易。若選擇原核表達系統(tǒng),則需要對宿主表達菌進行選擇和條件優(yōu)化,才能有利于該基因在體外表達重組蛋白。2.鴨腸炎病毒UL18基因的原核表達、抗體制備及應(yīng)用根據(jù)注冊的DEV UL18基因序列,用Primer Premier6.0軟件設(shè)計合成一對特異性擴增DEVUL18基因的引物。用該引物從DEV基因組中擴增UL18基因,并將其正向插入pET32a（+）原核表達質(zhì)粒... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：99 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
本論文的創(chuàng)新性工作
中文摘要
ABSTRACT
常用英文縮寫詞匯
第一部分 文獻綜述
    第一章 皰疹病毒UL18基因及其編碼蛋白的研究進展
        1 皰疹病毒UL18基因序列特點
        2 皰疹病毒UL18編碼蛋白特點
        3 UL18蛋白的作用
            3.1 VP23與核衣殼的形成
            3.2 VP23對衣殼關(guān)閉的作用
            3.3 VP23對病毒毒力的影響
            3.4 UL18蛋白限制NK細胞介導(dǎo)殺傷作用
        4 UL18蛋白的定位
        5 展望
第二部分 實驗研究
    第二章 鴨腸炎病毒UL18基因的序列特征及密碼子偏愛性分析
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 基因文庫
                1.1.2 實驗數(shù)據(jù)
                1.1.3 主要生物信息學(xué)分析軟件
            1.2 方法
                1.2.1 DEV UL18基因核酸序列的分子特性分析
                1.2.2 DEV UL18基因編碼蛋白序列的分子特性分析
                1.2.3 DEV UL18基因的密碼子偏愛性分析
        2 結(jié)果
            2.1 DEV UL18基因核酸序列的分子特征
            2.2 DEV UL18基因編碼蛋白序列的分子特征
                2.2.1 DEV UL18基因編碼蛋白的氨基酸組成分析
                2.2.2 DEV UL18基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域
                2.2.3 DEV UL18基因編碼蛋白的系統(tǒng)進化樹
                2.2.4 DEV UL18基因編碼蛋白信號肽切割位點預(yù)測
                2.2.5 DEV UL18基因編碼蛋白磷酸化位點預(yù)測
                2.2.6 DEV UL18基因編碼蛋白糖基化位點預(yù)測
                2.2.7 DEV UL18基因編碼蛋白跨膜區(qū)預(yù)測
                2.2.8 DEV UL18基因編碼蛋白疏水性分析
                2.2.9 DEV UL18基因編碼蛋白抗原性分析
                2.2.10 DEV UL18基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析
                2.2.11 DEV UL18基因編碼蛋白的亞細胞定位
            2.3 DEV UL18基因的密碼子偏愛性
                2.3.1 DEV UL18基因與27種皰疹病毒UL18基因密碼子使用偏愛性分析
                2.3.2 DEV UL18基因密碼子使用和氨基酸組成的偏愛性分析
                2.3.3 DEV UL18基因密碼子使用與人、酵母和大腸桿菌密碼子使用偏愛性比較
        3 討論
            3.1 DEV UL18基因的分子特性
            3.2 DEV UL18基因編碼蛋白的抗原性
            3.3 DEV UL18編碼蛋白與其它皰疹病毒UL18蛋白間的系統(tǒng)進化關(guān)系
            3.4 DEV UL18基因的密碼子偏愛性
        4 小結(jié)
        Abstract
    第三章 鴨腸炎病毒UL18基因的原核表達、抗體制備及應(yīng)用
        摘要
        1 材料
            1.1 菌株、毒株和質(zhì)粒
            1.2 實驗動物
            1.3 主要試劑及其配制
                1.3.1 主要試劑
                1.3.2 主要試劑配制
            1.4 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 DEV UL18基因的克隆
                2.1.1 引物設(shè)計
                2.1.2 DNA的提取
                2.1.3 PCR擴增DEV UL18基因
                2.1.4 DEV UL18基因的PCR產(chǎn)物回收
                2.1.5 DEV UL18基因的T-載體克隆與鑒定
            2.2 DEV UL18基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.2.1 pMD18-T-UL18與表達質(zhì)粒pET-32a（+）的提取、酶切與回收
                2.2.2 構(gòu)建重組表達菌株
            2.3 DEV UL18重組蛋白的誘導(dǎo)表達及條件優(yōu)化
                2.3.1 重組表達質(zhì)粒pET32a-UL18的誘導(dǎo)表達
                2.3.2 重組質(zhì)粒pET32a-UL18誘導(dǎo)條件優(yōu)化
            2.4 DEV UL18重組蛋白的純化
                2.4.1 重組表達蛋白的可溶性分析
                2.4.2 重組質(zhì)粒pET32a-UL18大量誘導(dǎo)表達
                2.4.3 重組蛋白的純化
                2.4.4 重組蛋白的復(fù)性
                2.4.5 Western Blotting檢測
            2.5 兔抗DEV UL18重組蛋白抗體的制備及純化
                2.5.1 兔抗重組蛋白高免血清的制備
                2.5.2 免抗DEV UL18重組蛋白效價測定
                2.5.3 兔抗重組蛋白高免血清IgG的純化及鑒定
            2.6 基于DEV UL18重組蛋白間接ELISA法檢測DEV抗體的應(yīng)用
                2.6.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定
                2.6.2 最佳酶標(biāo)二抗工作濃度的確定
                2.6.3 DEV-UL18-ELISA方法臨界值的確定
                2.6.4 特異性試驗
                2.6.5 敏感性試驗
                2.6.6 重復(fù)性試驗
            2.7 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫組化法檢測DEV感染鴨組織的應(yīng)用
                2.7.1 組織樣品的采集與處理
                2.7.2 間接免疫酶組化檢測DEV UL18蛋白方法的建立
                2.7.3 間接免疫酶組化檢測DEV UL18蛋白方法的優(yōu)化
                2.7.4 特異性實驗
                2.7.5 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
                2.7.6 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫組化法對DEV感染鴨組織的檢測
            2.8 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法檢測DEV感染鴨組織的應(yīng)用
                2.8.1 組織樣品的采集與處理
                2.8.2 間接免疫熒光檢測DEV UL18蛋白方法的建立
                2.8.3 間接免疫熒光檢測DEV感染鴨組織UL18蛋白方法的優(yōu)化
                2.8.4 特異性實驗
                2.8.5 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
                2.8.6 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法對DEV感染鴨組織的檢測
            2.9 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法檢測DEV感染宿主細胞的應(yīng)用
                2.9.1 免疫熒光檢測DEV感染宿主細胞方法的建立
                2.9.2 免疫熒光檢測DEV感染宿主細胞條件的優(yōu)化
                2.9.3 免疫熒光特異性檢測
                2.9.4 間接免疫熒光檢測的結(jié)果判定
                2.9.5 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法對DEV感染宿主細胞的檢測
        3 結(jié)果
            3.1 DEV UL18基因的PCR擴增結(jié)果
            3.2 DEV UL18基因的T-克隆鑒定結(jié)果
            3.3 原核表達質(zhì)粒pET32a-UL18的構(gòu)建及鑒定結(jié)果
            3.4 重組質(zhì)粒pET32a-UL18的誘導(dǎo)表達結(jié)果
            3.5 重組質(zhì)粒pET32a-UL18的誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化結(jié)果
                3.5.1 表達宿主菌優(yōu)化
                3.5.2 溫度條件優(yōu)化
                3.5.3 時間條件優(yōu)化
                3.5.4 IPTG濃度優(yōu)化
            3.6 重組蛋白pET32a/DEV-UL18的純化結(jié)果
                3.6.1 重組表達蛋白的可溶性分析
                3.6.2 重組蛋白的大量純化
            3.7 兔抗重組蛋白pET32a/DEV-UL18抗體效價檢測結(jié)果
            3.8 兔抗重組蛋白pET32a/DEV-UL18抗體IgG的純化結(jié)果
            3.9 Western Blotting檢測結(jié)果
            3.10 基于DEV UL18重組蛋白間接ELISA法檢測DEV抗體的應(yīng)用
                3.10.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度
                3.10.2 最佳酶標(biāo)二抗工作濃度
                3.10.3 ELISA陰陽性臨界值的判定標(biāo)準(zhǔn)
                3.10.4 特異性試驗的檢測結(jié)果
                3.10.5 敏感性試驗的檢測結(jié)果
                3.10.6 重復(fù)性試驗的檢測結(jié)果
            3.11 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫組化的應(yīng)用
                3.11.1 間接免疫酶組化檢測DEV感染鴨的組織切片優(yōu)化結(jié)果
                3.11.2 特異性試驗結(jié)果
                3.11.3 間接免疫酶組化法檢測DEV感染鴨組織切片結(jié)果
            3.12 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光檢測DEV感染組織的應(yīng)用
                3.12.1 間接免疫熒光檢測DEV感染鴨組織方法的優(yōu)化
                3.12.2 特異性試驗
                3.12.3 間接免疫熒光法檢測DEV感染鴨組織的結(jié)果
            3.13 基于兔抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光檢測DEV感染宿主細胞的應(yīng)用
                3.13.1 間接免疫熒光法檢測DEV感染宿主細胞飛片條件優(yōu)化結(jié)果
                3.13.2 特異性試驗
                3.13.3 間接免疫熒光檢測DEV感染宿主細胞飛片結(jié)果
        4 討論
            4.1 DEV UL18基因的引物設(shè)計和克隆測序
            4.2 DEV UL18基因的克隆測序和表達載體的選擇
            4.3 皰疹病毒UL18基因的表達
            4.4 兔抗重組蛋白pET32a/DEV-UL18抗體IgG的制備和純化
            4.5 基于DEV UL18重組蛋白間接ELISA法檢測DEV抗體方法的應(yīng)用
            4.6 基于兔抗DEV UL18重組蛋白抗體介導(dǎo)的免疫酶組化和免疫熒光法檢測UL18蛋白的應(yīng)用
                4.6.1 免疫酶組化檢測DEV UL18蛋白在組織分布方法的建立及應(yīng)用
                4.6.2 免疫熒光法檢測DEV UL18蛋白在組織分布方法的建立及應(yīng)用
                4.6.3 間接免疫熒光與間接免疫酶組化檢測DEV UL18蛋白在感染鴨體內(nèi)分布比較
            4.7 基于免抗DEV UL18重組蛋白IgG介導(dǎo)的免疫熒光法檢測UL18蛋白細胞定位
                4.7.1 關(guān)于蛋白在細胞內(nèi)定位的檢測方法
                4.7.2 皰疹病毒DEV UL18蛋白的細胞定位與其功能的關(guān)系
        5 小結(jié)
        Abstract
    第四章 鴨腸炎病毒UL18基因在感染宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄及表達特征
        摘要
        1 材料
            1.1 菌株、毒株和抗體
            1.2 實驗動物
            1.3 主要試劑及其配制
                1.3.1 細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑
                1.3.2 Western blotting檢測相關(guān)試劑
            1.4 主要儀器設(shè)備
        2 方法
            2.1 熒光定量RT-PCR檢測DEV UL18基因在感染宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄時相
                2.1.1 熒光定量PCR引物的設(shè)計、合成及特異性檢測
                2.1.2 鴨胚成纖維細胞（DEF）的培養(yǎng)
                2.1.3 DEV病毒的增值
                2.1.4 總RNA的提取
                2.1.5 DNA的去除
                2.1.6 RNA完整性及純度檢測
                2.1.7 反轉(zhuǎn)錄
                2.1.8 目的片段的PCR擴增及回收
                2.1.9 熒光定量PCR
                2.1.10 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
                2.1.11 數(shù)據(jù)處理與分析
            2.2 Western blotting檢測DEV UL18在感染宿主細胞中的表達時相
                2.2.1 鴨胚成纖維細胞的培養(yǎng)
                2.2.2 DEV病毒的增殖及采樣
                2.2.3 SDS-PAGE電泳
                2.2.4 Western blotting檢測
        3 結(jié)果
            3.1 DEV UL18基因在感染宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄時相結(jié)果
                3.1.1 熒光定量PCR引物特異性檢測
                3.1.2 RNA完整性及純度檢測
                3.1.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線
                3.1.4 DEV UL18基因在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄特征
            3.2 DEV UL18基因在感染宿主細胞中的表達時相結(jié)果
        4 討論
            4.1 實時熒光定量PCR檢測DEV UL18基因在DEF細胞中轉(zhuǎn)錄時相方法的選擇
            4.2 DEV UL18基因的轉(zhuǎn)錄特征分析
            4.3 DEV UL18基因的表達特征分析
        5 小結(jié)
        Abstract
結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]鴨瘟病毒UL51基因在COS-7細胞中的瞬時表達[J]. 沈嬋娟,程安春,汪銘書,郭宇飛,信洪一,徐超,賈仁勇,韓新峰.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2009(10)
[2]鴨瘟病毒gC基因的克隆及其分子特性分析[J]. 徐超,李欣然,信洪一,練蓓,程安春,汪銘書,朱德康,賈仁勇,羅啟慧,陳孝躍.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2008(12)
[3]檢測石蠟切片中鴨病毒性腸炎病毒間接原位PCR方法的建立[J]. 程安春,廖永洪,朱德康,汪銘書,羅啟慧,賈仁勇,陳孝躍.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(12)
[4]鴨腸炎病毒UL6基因B細胞表位的預(yù)測及其主要抗原域的原核表達[J]. 孫濤,程安春,汪銘書,郭宇飛,賈仁勇,沈嬋娟.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2008(11)
[5]鴨瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表達及在病毒感染宿主亞細胞中的定位分析[J]. 招麗嬋,程安春,汪銘書,袁桂萍,賈仁勇,周登春,葛菡,孫濤,陳孝躍.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2008(08)
[6]間接免疫熒光染色檢測石蠟切片中的鴨病毒性腸炎病毒和抗原定位[J]. 程安春,韓曉英,朱德康,汪銘書,袁桂萍,廖永洪,徐超.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2008(08)
[7]免疫組織化學(xué)技術(shù)在獸醫(yī)診斷中的應(yīng)用[J]. 萬美梅,孫彥偉,林乃鋒.  動物醫(yī)學(xué)進展. 2008(06)
[8]偽狂犬病病毒Ea株UL18基因的克隆、序列分析及表達[J]. 薛念波,肖少波,江云波,常天明,劉曼莉,趙騫,羅銳,陳煥春,方六榮.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2008(04)
[9]間接免疫熒光檢測石蠟切片中鴨腫頭出血癥病毒及抗原定位方法的初步建立[J]. 張舍郁,程安春,汪銘書,沈嬋娟,李傳峰.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2008(03)
[10]Application of an indirect immunofluorescent staining method for detection of Salmonella enteritidis in paraffin slices and antigen location in infected duck tissues[J]. Bin Yan, Shu-Xuan Deng, Zhen-Hua Zhang, Nian-Chun Yin, Ping Cao, Sheng-Yan Cao, Avian Disease Research Center, Collage of Veterinary Medicine of Sichuan Agriculture University, Yaan 625014, Sichuan Province, China Ming-Shu Wang, College of Life Science and Technology of Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, Sichuan Province, China An-Chun Cheng, Ming-Shu Wang, Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, College of Veterinary Medicine of Sichuan Agriculture University, Yaan 625014, Sichuan Province, China.  World Journal of Gastroenterology. 2008(05)

博士論文
[1]偽狂犬病病毒上海株gE～-/gI～-/GFP～+/LacZ～+缺失株的構(gòu)建及其免疫原性初步研究[D]. 姜焱.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2002

碩士論文
[1]鴨瘟病毒UL26.5基因的原核表達及在病毒感染細胞定位研究[D]. 張瑤.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[2]鴨瘟強毒TK基因的原核表達及在感染鴨組織亞細胞定位研究[D]. 葛菡.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號：3143977