為建立一種快速檢測羊源尸毒梭菌的方法,本研究參考尸毒梭菌23S rRNA基因、高致病性毒力島irp2基因和溶血素hlyA基因的特異序列,設(shè)計合成3對特異性引物,通過優(yōu)化條件建立了檢測羊源尸毒梭菌的三重PCR方法,并評估了其特異性、敏感性和重復(fù)性。將尸毒梭菌人工感染小鼠,利用建立的三重PCR方法檢測死亡小鼠各組織中的尸毒梭菌,并與16S rDNA PCR方法的檢測結(jié)果相比較。結(jié)果顯示,該三重PCR方法優(yōu)化后的條件為:3對基因上、下游引物均為1μL終濃度均為10μmol/L,退火溫度59℃。該方法僅對尸毒梭菌擴(kuò)增出23S rRNA、irp2和hlyA 3個目的基因,而對蠟樣芽孢桿菌、類志賀鄰單胞菌、乳酸片球菌、藤黃微球菌、霍氏腸桿菌、陰溝腸桿菌、大腸桿菌、檸檬酸桿菌及枯草芽孢桿菌均未擴(kuò)增出目的基因;對尸毒梭菌DNA的最低檢出量為2.76×101拷貝/μL,敏感性較高;該方法對同一稀釋度及不同稀釋度尸毒梭菌DNA的重復(fù)性檢測結(jié)果均一致,重復(fù)性較好。人工感染1.5×109cfu/mL的尸毒梭菌的小鼠12 h全部死亡,對照組小鼠未出現(xiàn)發(fā)病和死亡,且經(jīng)本研究建立的三重PCR方法檢測結(jié)果顯示,每只死... 

【文章來源】：中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2020,42(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

三重PCR方法退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)測定尸毒梭菌DNA濃度為77.20 ng/μL，經(jīng)計算為2.76×1010拷貝/μL。將其10被倍比稀釋后（2.76×1010拷貝/μL～2.76×100拷貝/μL）作為模板，經(jīng)該三重PCR方法擴(kuò)增。結(jié)果顯示，該方法對該菌DNA的最低檢出量為2.76×101拷貝/μL（圖3）。表明，該方法的敏感性較高。圖3 三重PCR的敏感性檢測結(jié)果

三重PCR的敏感性檢測結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]腸出血性大腸桿菌O157多重PCR檢測方法的建立[J]. 張昕楊,李火明,夏穎,李干武,蔡文通.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2020(04)
[2]一株羊源尸毒梭菌的鑒定及生物學(xué)特性研究[J]. 豆朋朋,魏勇,王利.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報. 2020(02)
[3]禽源性大腸桿菌HPI毒力島irp2基因PCR檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 王艷萍,董林,郭時金,徐倩倩,莫玲,王金良,劉吉山,沈志強(qiáng).  中國獸醫(yī)雜志. 2017(01)
[4]變質(zhì)兔肉罐頭檢出尸體梭菌產(chǎn)毒株的研究[J]. 田軍川,黃金文,宮麗萍,劉敏娟,冠光弟,徐迪誠,張瀾,劉曉龍.  中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志. 1991(03)

碩士論文
[1]大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌主要毒力因子多重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立和應(yīng)用[D]. 夏燦.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]腹瀉仔豬源E.coli的分離及毒力因子分子流行情況調(diào)查[D]. 楊宇.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]產(chǎn)腸毒素大腸桿菌溶血素HlyA的原核表達(dá)、多抗制備及相關(guān)功能探析[D]. 楊樣.揚(yáng)州大學(xué) 2015



本文編號：3139658