豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、腹瀉和食欲下降為基本特征，各種年齡階段的豬可能感染，但仔豬最易感。該病最初發(fā)現(xiàn)時發(fā)病率高，死亡率較低，但是近年來PEDV引起山東的仔豬腹瀉爆發(fā)，病死率達(dá)100%。為了有效防治該病，本研究建立了檢測PEDV的熒光定量PCR診斷方法和檢測PEDV抗體的間接ELISA檢測方法。本研究共分為三個部分：1PEDV熒光定量PCR的建立根據(jù)PEDV的M基因序列，本研究合成了針對該序列的Taqman探針和引物，建立了檢測PEDV的絕對熒光定量PCR方法，繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-2.146X+22.769，各個參數(shù)為Slope=-2.146，擴(kuò)增效率：E=10-1/斜率-1=10-1/-2.146-1=192.433%，相關(guān)系數(shù)：R2=0.994。試驗(yàn)證明該方法特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高、最低可檢測到10copies/μL。應(yīng)用建立的熒光定量PCR對來自山東省的40份臨床呈腹瀉癥狀的病料進(jìn)行了檢測，檢測出30份PEDV陽性，檢出率為75%，說明PEDV引起山東省大部分豬場的仔豬腹瀉的原因之一。2PEDV... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
符號說明
中文摘要
ABSTRACT
1 引言
    1.1 PEDV 的形態(tài)學(xué)
        1.1.1 PEDV 的生物學(xué)特性
    1.2 PEDV 的分子生物學(xué)研究
        1.2.1 基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.2.2 結(jié)構(gòu)蛋白
        1.2.3 非結(jié)構(gòu)蛋白
        1.2.4 N 蛋白的特點(diǎn)
    1.3 PEDV 的基因分型和流行特點(diǎn)
    1.4 豬流行性腹瀉病毒的流行病學(xué)
    1.5 豬流行性腹瀉病毒的臨床癥狀和病理變化
        1.5.1 臨床癥狀
        1.5.2 病理變化
    1.6 豬流行性腹瀉病毒致病機(jī)理
    1.7 豬流行性腹瀉病毒的增殖培養(yǎng)
    1.8 豬流行性腹瀉病毒的診斷方法
        1.8.1 根據(jù)臨床癥狀和病理剖檢變化初步診斷
        1.8.2 人工感染試驗(yàn)
        1.8.3 免疫電鏡法（IEM）
        1.8.4 原位雜交技術(shù)（ISH）
        1.8.5 免疫熒光法
        1.8.6 血清中和試驗(yàn)
        1.8.7 膠體金抗體檢測技術(shù)
        1.8.8 RT-PCR 法
        1.8.9 反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫 PCR 法
        1.8.10 熒光定量 PCR 法
        1.8.11 ELISA 法
    1.9 PEDV 的疫苗預(yù)防和治療
        1.9.1 疫苗預(yù)防
        1.9.2 治療
    1.10 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 毒株和病料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 試驗(yàn)中配制的試劑
    2.2 方法
        2.2.1 PEDV 熒光定量 PCR 方法的建立的材料與方法
        2.2.2 PEDV 的 N 蛋白基因原核表達(dá)的材料與方法
        2.2.3 PEDV N 蛋白間接 ELISA 方法建立和初步應(yīng)用的材料與方法
3 結(jié)果與分析
    3.1 PEDV 熒光定量 PCR 方法的建立的結(jié)果
        3.1.1 熒光引物的 PCR 檢測
        3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備
        3.1.3 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化
        3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
        3.1.5 靈敏性試驗(yàn)
        3.1.6 特異性試驗(yàn)
        3.1.7 重復(fù)性試驗(yàn)
        3.1.8 臨床病料的檢測結(jié)果
    3.2 PEDV 的 N 蛋白基因原核表達(dá)的結(jié)果
        3.2.1 PEDV N 基因 PCR 擴(kuò)增
        3.2.2 重組質(zhì)粒 pET30a-PEDVN 的鑒定
        3.2.3 重組質(zhì)粒的初步表達(dá)
        3.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
        3.2.5 蛋白的純化
        3.2.6 Western-blot 驗(yàn)證表達(dá)蛋白
    3.3 PEDV N 蛋白間接 ELISA 方法建立和初步應(yīng)用的結(jié)果
        3.3.1 間接 ELISA 方法的優(yōu)化
        3.3.2 臨床血清的檢測
4 討論
    4.1 熒光定量 PCR 方法的建立和應(yīng)用
    4.2 PEDV N 蛋白的原核表達(dá)和條件優(yōu)化的研究
    4.3 PEDV N 蛋白間接 ELISA 的研究
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
碩士期間發(fā)表文章


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉膠體金抗體檢測技術(shù)的建立及其應(yīng)用[J]. 張利勃,周鐵忠,王珅,高慎陽.  中國農(nóng)學(xué)通報(bào). 2011(03)
[2]表達(dá)豬流行性腹瀉病毒中和抗原位點(diǎn)的重組干酪乳桿菌免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,劉敏,唐麗杰,李一經(jīng).  中國獸醫(yī)科學(xué). 2010(07)
[3]表面表達(dá)豬流行性腹瀉病毒核蛋白蛋白的重組干酪乳桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答[J]. 葛俊偉,姜艷平,汪淼,喬薪瑗,劉敏,唐麗杰,李一經(jīng).  生物工程學(xué)報(bào). 2009(06)
[4]豬流行性腹瀉病毒M基因及其片段原核表達(dá)效果分析[J]. 高慎陽,鄒運(yùn)明,李一經(jīng).  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2007(01)
[5]豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白抗原間接ELISA抗體檢測方法的建立[J]. 孫東波,馮力,時洪艷,劉勝旺,陳洪巖,佟有恩,李偉杰,王明,馬思奇,陳建飛.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2006(05)
[6]豬傳染性胃腸炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的構(gòu)建及其免疫效力[J]. 任曉峰,尹杰超,司微,李一經(jīng),劉寶全.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2006(03)
[7]流行性腹瀉病毒E基因與pSFV重組RNA的構(gòu)建[J]. 余麗蕓,侯喜林.  黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào). 2005(01)
[8]豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒疫苗的研究[J]. 佟有恩,馮力,李偉杰,朱遠(yuǎn)茂,王明,馬思奇.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 1999(06)
[9]豬流行性腹瀉的免疫研究[J]. 錢永清,聞人楚,唐永蘭,陳培龍,蘇萬國,許大新,張國強(qiáng).  上海畜牧獸醫(yī)通訊. 1999(03)
[10]豬流行性腹瀉弱毒株的培育[J]. 佟有恩,馮力,李偉杰,王明,馬思奇.  中國畜禽傳染病. 1998(06)

碩士論文
[1]豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉快速診斷方法的建立及S基因的表達(dá)[D]. 劉鄧.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號：3128435