本試驗(yàn)以商用的益生芽孢桿菌為基礎(chǔ),從基因角度系統(tǒng)分析菌株的安全性,為益生芽孢桿菌的選育提供參考。從6種市售的微生態(tài)制劑中分離得到6株對應(yīng)的芽孢桿菌,即枯草芽孢桿菌S-1、枯草芽孢桿菌S-2、蠟樣芽孢桿菌C-1、蠟樣芽孢桿菌C-2、地衣芽孢桿菌L-1、地衣芽孢桿菌L-2,分別從藥敏分析、耐藥性質(zhì)粒檢測、耐藥性基因檢測和毒力基因檢測4個(gè)方面系統(tǒng)評估6株菌的基因安全性。結(jié)果顯示:地衣芽孢桿菌L-1和L-2均對紅霉素有耐藥性,其耐藥性由位于染色體DNA上的ermD/K1a基因編碼,而非質(zhì)粒編碼;2株蠟樣芽孢桿菌C-1和C-2均能特異性檢測到腸毒素基因hblA、hblB、hblC、hblD、nheA、nheB和nheC;2株地衣芽孢桿菌L-1和L-2均能特異性檢測到腸毒素基因hblD和nheC;枯草芽孢桿菌S-1能特異性檢測到腸毒素基因hblD、nheC和cytK,枯草芽孢桿菌S-2能特異性檢測到腸毒素基因hblD。上述結(jié)果表明,6株益生芽孢桿菌作為商用活菌制劑均無耐藥性風(fēng)險(xiǎn),但每一個(gè)菌株攜帶一種或多種腸毒素基因,毒力基因的存在是否與益生菌的使用安全相關(guān)尚無定論,但其潛在的安全性問題在益生芽孢桿... 

【文章來源】：中國畜牧雜志. 2020,56(08)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

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地衣芽孢桿菌中L-1、L-2質(zhì)粒檢測結(jié)果

圖1 地衣芽孢桿菌中L-1、L-2質(zhì)粒檢測結(jié)果益生芽孢桿菌中是否存在毒力基因并表達(dá)并產(chǎn)生毒素是安全性評價(jià)的另一重要方面。蠟樣芽孢桿菌中可能含有腸毒素和嘔吐毒素，這些毒素也可能存在于其他種的芽孢桿菌中[18-19]。與腸毒素相關(guān)的主要毒力基因有4個(gè)[8]，分別為溶血素Hbl、非溶血性腸毒素Nhe、細(xì)胞毒素K(CytK）、腸毒素T(BceT），其中編碼溶血素Hbl的基因由1個(gè)操縱子組成，包括hblA、hblB、hblC和hblD 4個(gè)基因，需要hblA、hblC和hblD 3個(gè)基因均表達(dá)時(shí)才會產(chǎn)生溶血素。編碼非溶血性腸毒素Nhe的3個(gè)組分的基因分別是nheA、nheB和nheC，這3個(gè)基因共表達(dá)時(shí)毒性最大。細(xì)胞毒素K具有細(xì)胞毒性，由cytK基因編碼[20]。腸毒素T由bceT基因編碼，已有研究證實(shí)腸毒素T沒有生物活性，可能不參與腸毒性危害[21]。嘔吐毒素主要由ces基因編碼，它具有抗酸性環(huán)境，抗蛋白水解酶裂解及耐熱的特點(diǎn)，危害較大。在前期芽孢桿菌安全性研究中，文英會等[22]在分離自飼料添加劑的蠟樣芽孢桿菌中檢測出嘔吐毒素基因ces,Duc等[23]在來自于Bactisubtil、BiostudylDL和Subtyl益生菌制劑中的蠟樣芽孢桿菌中均檢測到hbl和nhe的腸毒素基因。Ahaotu等[24]研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌B13b和蠟樣芽孢桿菌A1均攜帶hbl和nhe基因。Stenfors[25]對26株蠟樣芽孢桿菌的毒力基因nhe、hbl、bceT、cytK進(jìn)行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)所有菌株都至少攜帶1個(gè)毒力基因；進(jìn)一步的細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中有17株菌可以產(chǎn)生毒素。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中，Rowan等[26]在分離自奶粉中的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中檢測到了編碼HBL的4個(gè)基因，并在進(jìn)一步腸毒性驗(yàn)證結(jié)果中呈陽性。這些結(jié)果表明，芽孢桿菌攜帶毒力基因及產(chǎn)生毒素的幾率較大。本研究中使用的6株益生芽孢桿菌均表現(xiàn)為嘔吐毒素基因陰性，但所有菌株均檢測為腸毒素基因陽性。雖然陽性的腸毒性基因檢出并不意味著菌株一定產(chǎn)生腸毒性，需要結(jié)合具體的腸毒素進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，但還是存在潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)，其中2株蠟樣芽孢桿菌攜帶編碼溶血素Hbl和非溶血性腸毒素Nhe的全部基因，其潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)較其他4株菌株更大。需要注意的是，并非所有芽孢桿菌都攜帶毒力基因，Sorokulova等[14]在微生態(tài)制劑Biposporine?中的枯草芽孢桿菌BS3和地衣芽孢桿菌BL31均沒有到檢測hbl、nhe、bceT和cytK基因。因此，為了確保益生芽孢桿菌的使用安全，在對菌株選育時(shí)，一定要對其進(jìn)行安全評估，對常見的毒力基因做廣泛性篩查，并盡可能減少攜帶腸毒性基因的菌株使用。若候選菌株益生性能優(yōu)良，需要根據(jù)陽性基因的檢出情況，再對毒素的活性作進(jìn)一步確認(rèn)，以確保益生菌的使用安全。

益生芽孢桿菌中是否存在毒力基因并表達(dá)并產(chǎn)生毒素是安全性評價(jià)的另一重要方面。蠟樣芽孢桿菌中可能含有腸毒素和嘔吐毒素，這些毒素也可能存在于其他種的芽孢桿菌中[18-19]。與腸毒素相關(guān)的主要毒力基因有4個(gè)[8]，分別為溶血素Hbl、非溶血性腸毒素Nhe、細(xì)胞毒素K(CytK）、腸毒素T(BceT），其中編碼溶血素Hbl的基因由1個(gè)操縱子組成，包括hblA、hblB、hblC和hblD 4個(gè)基因，需要hblA、hblC和hblD 3個(gè)基因均表達(dá)時(shí)才會產(chǎn)生溶血素。編碼非溶血性腸毒素Nhe的3個(gè)組分的基因分別是nheA、nheB和nheC，這3個(gè)基因共表達(dá)時(shí)毒性最大。細(xì)胞毒素K具有細(xì)胞毒性，由cytK基因編碼[20]。腸毒素T由bceT基因編碼，已有研究證實(shí)腸毒素T沒有生物活性，可能不參與腸毒性危害[21]。嘔吐毒素主要由ces基因編碼，它具有抗酸性環(huán)境，抗蛋白水解酶裂解及耐熱的特點(diǎn)，危害較大。在前期芽孢桿菌安全性研究中，文英會等[22]在分離自飼料添加劑的蠟樣芽孢桿菌中檢測出嘔吐毒素基因ces,Duc等[23]在來自于Bactisubtil、BiostudylDL和Subtyl益生菌制劑中的蠟樣芽孢桿菌中均檢測到hbl和nhe的腸毒素基因。Ahaotu等[24]研究發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌B13b和蠟樣芽孢桿菌A1均攜帶hbl和nhe基因。Stenfors[25]對26株蠟樣芽孢桿菌的毒力基因nhe、hbl、bceT、cytK進(jìn)行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)所有菌株都至少攜帶1個(gè)毒力基因；進(jìn)一步的細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中有17株菌可以產(chǎn)生毒素。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中，Rowan等[26]在分離自奶粉中的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中檢測到了編碼HBL的4個(gè)基因，并在進(jìn)一步腸毒性驗(yàn)證結(jié)果中呈陽性。這些結(jié)果表明，芽孢桿菌攜帶毒力基因及產(chǎn)生毒素的幾率較大。本研究中使用的6株益生芽孢桿菌均表現(xiàn)為嘔吐毒素基因陰性，但所有菌株均檢測為腸毒素基因陽性。雖然陽性的腸毒性基因檢出并不意味著菌株一定產(chǎn)生腸毒性，需要結(jié)合具體的腸毒素進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，但還是存在潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)，其中2株蠟樣芽孢桿菌攜帶編碼溶血素Hbl和非溶血性腸毒素Nhe的全部基因，其潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)較其他4株菌株更大。需要注意的是，并非所有芽孢桿菌都攜帶毒力基因，Sorokulova等[14]在微生態(tài)制劑Biposporine?中的枯草芽孢桿菌BS3和地衣芽孢桿菌BL31均沒有到檢測hbl、nhe、bceT和cytK基因。因此，為了確保益生芽孢桿菌的使用安全，在對菌株選育時(shí)，一定要對其進(jìn)行安全評估，對常見的毒力基因做廣泛性篩查，并盡可能減少攜帶腸毒性基因的菌株使用。若候選菌株益生性能優(yōu)良，需要根據(jù)陽性基因的檢出情況，再對毒素的活性作進(jìn)一步確認(rèn)，以確保益生菌的使用安全。4 結(jié)論

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]飼料和飼料添加劑中蠟樣芽孢桿菌分離鑒定及其嘔吐毒素基因檢測[J]. 文英會,李孟,李金磊,高延玲,吳志明.  飼料研究. 2019(04)
[2]整腸生菌株遺傳穩(wěn)定性及質(zhì)粒研究[J]. 李雪龍,陳偉,彭勃,于振德.  中國微生態(tài)學(xué)雜志. 2013(11)
[3]克勞芽孢桿菌體外益生特性初步研究[J]. 甘永琦,汪輝,陳向東,生麗丹,薛宇醒.  藥物生物技術(shù). 2010(04)
[4]雞源地衣芽孢桿菌耐藥性基因的定位[J]. 劉一塵,張春杰,程相朝,李銀聚,吳庭才.  中國家禽. 2009(13)



本文編號：3122171