禽白血病（Avian Leukosis）是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus）引起的一種易傳染的腫瘤性疾病。ALV能夠引起雞群患腫瘤性疾病,除了對(duì)雞群造成直接危害外,還可導(dǎo)致雞群免疫失敗,繼發(fā)感染,產(chǎn)蛋率降低等,給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失。到目前為止,該病還沒有研制出可用的疫苗和有效的治療藥物,只能采取凈化措施控制病毒的傳播。P27蛋白為ALV的衣殼蛋白、群特異性抗原,目前常運(yùn)用ELISA方法監(jiān)測P27抗原達(dá)到凈化雞群的目的。本研究中在原核表達(dá)技術(shù)的基礎(chǔ)上制備重組P27蛋白,建立檢測P27抗體的間接ELISA方法,并同時(shí)將P27蛋白作為免疫原免疫Balb/c小鼠和日本大耳白兔,分別制備單克隆抗體和多克隆抗體,建立檢測P27抗原的夾心ELISA檢測方法,為禽白血病的臨床快速診斷提供了有效工具。具體內(nèi)容包括：1.P27基因的原核表達(dá)ALV P27基因克隆至原核表達(dá)載體pET28a,構(gòu)建pET28a-P27重組質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）,經(jīng)IPTG16℃過夜誘導(dǎo)獲得以可溶形式高效表達(dá)的P27蛋白,對(duì)P27蛋白進(jìn)行鎳親和層析純化,并經(jīng)SDS-PAGE以及w... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 禽白血病病毒病原特性
        1.1 禽白血病病毒形態(tài)特征
        1.2 禽白血病病毒的理化性質(zhì)
        1.3 禽白血病病毒的分類
        1.4 禽白血病病毒基因組結(jié)構(gòu)
        1.5 P27蛋白
        1.6 禽白血病內(nèi)、外源性病毒
    2. 禽白血病病毒致病機(jī)理
    3. 禽白血病病理學(xué)
    4. 禽白血病流行病學(xué)
    5. 禽白血病的檢測方法及種群凈化
        5.1 禽白血病病毒的分離與鑒定
        5.2 間接生物實(shí)驗(yàn)
        5.3 PCR和RT-PCR
        5.4 ELISA
        5.5 種群凈化
    6. 研究的目的和意義
第二章 禽白血病病毒P27蛋白間接ELISA檢測方法的建立
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 毒株
        1.2 質(zhì)粒和血清
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
        1.5 主要培養(yǎng)基和溶液的配置
            1.5.1 抗生素
            1.5.2 培養(yǎng)基類
            1.5.3 瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)溶液
            1.5.4 Western blot相關(guān)溶液
            1.5.5 蛋白表達(dá)與檢測的相關(guān)溶液
            1.5.6 純化蛋白相關(guān)溶液的配置
            1.5.7 ELISA相關(guān)溶液
    2 方法
        2.1 P27基因的克隆
            2.1.1 引物設(shè)計(jì)
            2.1.2 P27基因的擴(kuò)增
            2.1.3 P27基因與克隆載體的連接
            2.1.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            2.1.5 對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定
        2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-P27的構(gòu)建及其鑒定
        2.3 P27蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白的純化
            2.3.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            2.3.2 P27蛋白誘導(dǎo)表達(dá)最佳條件的摸索
            2.3.3 P27蛋白表達(dá)形式的鑒定
            2.3.4 P27蛋白的純化
            2.3.5 P27蛋白的鑒定
        2.4 間接ELISA檢測方法的建立及其鑒定
            2.4.1 間接ELISA檢測方法的操作步驟
            2.4.2 P27蛋白最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定
            2.4.3 P27蛋白最佳包被條件的確定
            2.4.4 最佳封閉劑和封閉時(shí)間的確定
            2.4.5 檢測血清最佳作用時(shí)間的確定
            2.4.6 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度和最佳作用時(shí)間的確定
            2.4.7 最佳顯色時(shí)間的確定
            2.4.8 陰陽性臨界值的確定
            2.4.9 特異性實(shí)驗(yàn)
            2.4.10 敏感性實(shí)驗(yàn)
            2.4.11 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
            2.4.12 符合性實(shí)驗(yàn)
            2.4.13 包被抗原保存期實(shí)驗(yàn)
    3 結(jié)果
        3.1 P27基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.2 pMD18-P27亞克隆重組質(zhì)粒的鑒定
        3.3 pET28a-P27重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
        3.4 P27蛋白最佳誘導(dǎo)條件的摸索
        3.5 P27蛋白表達(dá)形式的鑒定
        3.6 P27蛋白的純化及蛋白濃度
        3.7 P27蛋白的western blot結(jié)果
        3.8 禽白血病病毒P27蛋白間接ELISA檢測方法的建立
            3.8.1 P27蛋白最佳包被濃度和血清稀釋度的確定
            3.8.2 最佳包被條件的確定
            3.8.3 最佳封閉劑和封閉時(shí)間的確定
            3.8.4 被檢血清最佳作用時(shí)間的確定
            3.8.5 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度和作用時(shí)間的確定
            3.8.6 最佳顯色時(shí)間的確定
            3.8.7 間接ELISA方法臨界值的確定
            3.8.8 間接ELISA特異性
            3.8.9 間接ELISA敏感性
            3.8.10 間接ELISA重復(fù)性
            3.8.11 間接ELISA符合性
            3.8.12 間接ELISA包被抗原保存期時(shí)間的確定
    4. 討論
        4.1 關(guān)于重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-P27
        4.2 關(guān)于P27蛋白的分析
        4.3 間接ELISA影響因素分析
        4.4 關(guān)于臨界值的判定
        4.5 間接ELISA檢測方法的評(píng)價(jià)
    5. 結(jié)論
第三章 禽白血病病毒P27蛋白夾心ELISA檢測方法的建立
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 蛋白與細(xì)胞
        1.3 主要試劑與材料
        1.4 主要儀器
        1.5 主要溶液的配制
            1.5.1 制備單克隆抗體相關(guān)溶液
            1.5.2 雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)相關(guān)溶液
            1.5.3 純化抗體相關(guān)溶液
            1.5.4 抗體檢測相關(guān)溶液
            1.5.5 ELISA相關(guān)溶液
    2 方法
        2.1 P27單克隆抗體的制備
            2.1.1 小鼠免疫
            2.1.2 細(xì)胞融合
            2.1.3 陽性雜交瘤的篩選和克隆
            2.1.4 單克隆抗體的生產(chǎn)和純化
            2.1.5 單抗生物學(xué)特性鑒定
        2.2 P27蛋白多克隆抗體的制備
            2.2.1 日本大耳白兔的免疫
            2.2.2 多克隆抗體的純化
            2.2.3 多克隆抗體的鑒定
        2.3 夾心ELISA檢測方法的建立及其鑒定
            2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)檢測樣品的選擇
            2.3.2 夾心ELISA方法的操作程序
            2.3.3 捕獲抗體的選擇
            2.3.4 捕獲抗體和檢測抗體最佳濃度的確定
            2.3.5 酶標(biāo)二抗最佳稀釋度的確定
            2.3.6 最佳顯色時(shí)間的確定
            2.3.7 標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品和標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品的確定
            2.3.8 最佳封閉劑和封閉時(shí)間的確定
            2.3.9 檢測樣品、多抗和酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間的確定
            2.3.10 陰陽性臨界值的確定
            2.3.11 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定
            2.3.12 敏感性試驗(yàn)
            2.3.13 特異性試驗(yàn)
            2.3.14 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)
            2.3.15 符合性實(shí)驗(yàn)
    3. 結(jié)果
        3.1 抗禽白血病病毒P27蛋白單克隆抗體的制備
            3.1.1 免疫Balb/C小鼠血清效價(jià)的測定
            3.1.2 雜交瘤細(xì)胞的建立
            3.1.3 單抗的生物學(xué)性質(zhì)鑒定
        3.2 抗禽白血病病毒P27蛋白多克隆抗體的制備
            3.2.1 免疫日本大耳白兔血清效價(jià)的測定
            3.2.2 純化后兔多抗SDS-PAGE分析及蛋白濃度的測定
            3.2.3 兔多抗的western blot鑒定
        3.3 禽白血病病毒P27蛋白夾心ELISA檢測方法的建立
            3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的選擇
            3.3.2 捕獲抗體的選擇
            3.3.3 捕獲抗體最佳包被濃度和檢測抗體最佳稀釋濃度的確定
            3.3.4 最佳酶標(biāo)二抗稀釋度的確定
            3.3.5 最佳顯色時(shí)間的確定
            3.3.6 標(biāo)準(zhǔn)陽性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照的確定
            3.3.7 最佳封閉劑和封閉時(shí)間的確定
            3.3.8 最佳抗原、兔多抗和酶標(biāo)二抗工作時(shí)間的確定
            3.3.9 夾心ELISA臨界值的確定
            3.3.10 夾心ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定
            3.3.11 夾心ELISA敏感性試驗(yàn)
            3.3.12 夾心ELISA特異性試驗(yàn)
            3.3.13 夾心ELISA重復(fù)性試驗(yàn)
            3.3.14 夾心ELISA符合性試驗(yàn)
    4. 討論
        4.1 單抗有關(guān)的影響因素
        4.2 多抗制備的影響因素
        4.3 夾心ELISA影響因素的分析
        4.4 夾心ELISA方法的評(píng)價(jià)
    5. 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3121202