發(fā)布時(shí)間：2021-04-04 00:18

　　孔雀石綠（malachite green,MG）是一種易溶于水和乙醇等的基礎(chǔ)染料,可在多種行業(yè)應(yīng)用,并曾用于水生動(dòng)物多種疾病如真菌病、寄生蟲病、細(xì)菌性疾病等的治療。但因其具有致癌等毒副作用,目前已被禁用。然而市場(chǎng)上仍有在水產(chǎn)品違法使用MG的現(xiàn)象,因此需要加強(qiáng)對(duì)該藥品殘留的檢測(cè)。本研究選擇羊駝免疫庫篩選抗MG納米抗體,通過噬菌體ELISA篩選高親和力和特異性的納米抗體。通過輔助噬菌體M13的救援,使得納米抗體基因（VHH）與噬菌體外殼蛋白基因融合表達(dá),從而使得VHH蛋白展示在噬菌體表面,通過有限稀釋篩選和多次洗脫的辦法,獲得含有目的基因的單個(gè)噬菌克隆;將重組質(zhì)粒PMES4-VHH轉(zhuǎn)化到表達(dá)細(xì)胞中,進(jìn)行體外表達(dá)。最后采用NI-NTA柱進(jìn)行His標(biāo)簽純化,得到抗MG納米抗體,并進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果顯示:噬菌體文庫成功構(gòu)建,庫容為3.2×10⁸ cfu/mL;通過ELISA篩選,得到16個(gè)具有抑制效果的噬菌體克隆,經(jīng)對(duì)噬菌體基因測(cè)序并翻譯,得到2種氨基酸序列;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株表達(dá)、純化,最后得到大小約為15 kDa的抗MG納米抗體,從而為MG的下一步... 

【文章來源】：中國動(dòng)物檢疫. 2020,37(12)

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

采用巢氏PCR擴(kuò)增羊駝全部VHH基因。第1輪PCR擴(kuò)增，采用前導(dǎo)區(qū)序列引物CALL001和恒定區(qū)序列引物CALL002進(jìn)行，結(jié)果擴(kuò)增得到600 bp和1 000 bp兩個(gè)條帶（圖2-A）；收集全部PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后用DNA膠回收試劑盒，切膠純化600 bp的PCR產(chǎn)物并備用。第2輪PCR擴(kuò)增，以切膠回收產(chǎn)物為模板，以VHH-F和VHH-R為引物，結(jié)果擴(kuò)增得到約350 bp的產(chǎn)物（圖2-B）。采用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，經(jīng)微量核酸測(cè)定儀定量后置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?.3 納米抗體文庫建立

用限制性內(nèi)切酶PstⅠ和Bst EⅡ?qū)Τ彩絇CR純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物和噬菌粒載體PMES4進(jìn)行雙酶切，經(jīng)電轉(zhuǎn)化、菌液涂布平板后，平板計(jì)數(shù)測(cè)得所構(gòu)建的噬菌體文庫菌落數(shù)達(dá)3.2×108 cfu/m L（圖3）。隨機(jī)從文庫菌落計(jì)數(shù)的平板上挑取20個(gè)單菌落，通過PCR鑒定VHH基因的插入率。結(jié)果（圖4）顯示，試驗(yàn)組中20個(gè)單菌落均特能異性擴(kuò)增出約350 bp的條帶，表明該文庫的克隆效率高達(dá)100%，由此可知噬菌體文庫的庫容為3.2×108 cfu/m L。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]抗犬瘟熱病毒VHH抗體噬菌體庫的構(gòu)建與篩選[J]. 王召陽,蔣亞君,劉雪婷,林偉東,鑫婷,侯紹華,郭曉宇,朱鴻飛,賈紅.  中國畜牧獸醫(yī). 2020(06)
[2]超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)魚類中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物[J]. 師真,李文廷,張瑞雨,歐利華,梁孟軍,趙麗.  食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào). 2020(09)
[3]2017～2019年昆明市市售食用魚中幾種違禁藥物分析[J]. 師真,趙俊麗,李文廷,梁志堅(jiān),馬曉年,趙麗.  食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào). 2020(06)
[4]對(duì)硫磷納米抗體篩選及分子識(shí)別機(jī)制研究[J]. 張玉琪,張瑾如,王鋒,李家冬,司睿,呂麗珊,沈玉棟,王弘,HAMMOCK Bruce D,孫遠(yuǎn)明.  分析化學(xué). 2019(09)
[5]2013—2018年湛江進(jìn)出口水產(chǎn)品獸藥殘留結(jié)果分析[J]. 林锏銳,唐媛媛,詹海毅,馬聰,伍志強(qiáng),李昉.  檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊. 2019(03)
[6]2018年陜西省水產(chǎn)品中4種獸藥殘留的風(fēng)險(xiǎn)分析[J]. 范芳芳,樊成,魏寧果.  農(nóng)產(chǎn)品加工. 2019(11)
[7]水產(chǎn)品中孔雀石綠快速檢測(cè)產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)估[J]. 苑婷婷,儲(chǔ)成群,肖毅美,黃彬昌,李金燕.  山東化工. 2018(15)
[8]模擬運(yùn)輸條件下孔雀石綠及其代謝物在鱖體內(nèi)的殘留消除規(guī)律[J]. 李麗春,劉書貴,尹怡,馬麗莎,單奇,戴曉欣,鄭光明.  中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn). 2016(06)
[9]水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留的毒性作用及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[J]. 胡浩光,劉少彬,李緒鵬,彭家杰.  農(nóng)業(yè)與技術(shù). 2016(19)
[10]孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石綠在鯽魚組織中的分布及消除情況研究[J]. 銀旭紅,謝世紅,徐節(jié)華,歐陽敏,李彩剛.  江西水產(chǎn)科技. 2016(03)

碩士論文
[1]草魚體內(nèi)孔雀石綠代謝規(guī)律及殘留分析[D]. 薛燕妮.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]重金屬Cd納米抗體的制備及其免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[D]. 姜忍忍.上海師范大學(xué) 2014



本文編號(hào)：3117360