本研究從廣東湛江、清遠(yuǎn)和山西太原3個地區(qū)分離出13株豬瘟陽性毒株，選擇基因分型最可靠的NS5B區(qū)域，設(shè)計一對擴增片段大小為965bp的引物�；蛳嗨菩苑治霰砻�，同一地區(qū)分離的毒株相似性高，可達(dá)99.7%。豬瘟分離株與基因2型參考野毒株（HQ148063）序列相似性最高（95.8%），與3型豬瘟毒株（L49347）相似性最低（84.3%）。CSFV分離株與基因2型參考野毒株（HQ148063）基因推導(dǎo)的氨基酸相似性最高（95.7%），與基因3型參考野毒株（L49347）氨基酸相似性最低（84.0%）。遺傳進(jìn)化分析中，本研究中分離的豬瘟毒株均屬于基因2型。為建立一種簡便快速鑒別豬瘟野毒與疫苗弱毒的分子診斷方法，本研究基于HRM檢測技術(shù)對臨床樣本進(jìn)行了PCR-HRM分析。參考NCBI中收入的29株野毒株與9株疫苗株基因序列進(jìn)行多序列比對分析和在線模擬篩選，在3′UTR區(qū)設(shè)計一對擴增片段大小為200bp左右的引物。分別以豬瘟分離株和兔化弱毒疫苗株的mRNA為模板，在反應(yīng)前加入LC飽和熒光染料進(jìn)行RT-PCR擴增，并對擴增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析。HRM曲線圖顯示兩種毒株在70℃-90℃溫度范圍內(nèi)均有... 

【文章來源】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
前言
第一章 研究綜述
    1 豬瘟病毒
        1.1 豬瘟病毒分子生物學(xué)特征
            1.1.1 CSFV 基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
            1.1.2 CSFV 基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白及功能
            1.1.3 非編碼區(qū)及特性
            1.1.4 CSFV 基因分型
        1.2 豬瘟流行病學(xué)狀況
        1.3 常用的豬瘟疫苗
            1.3.1 豬瘟標(biāo)記疫苗
            1.3.2 豬瘟弱毒疫苗
        1.4 豬瘟實驗室診斷技術(shù)
            1.4.1 CSFV 常規(guī)實驗室診斷技術(shù)
            1.4.2 CSFV 分子診斷技術(shù)
            1.4.3 豬瘟野毒株與疫苗株的鑒別診斷
    2 高分辨率溶解曲線
        2.1 適用于 HRM 的染料和儀器
        2.2 HRM 的運用
    3 本研究目的與意義
第二章 豬瘟野毒株分離鑒定及與疫苗株 HRM 鑒別診斷
    1 材料
        1.1 病料的收集
        1.2 主要試驗試劑
        1.3 宿主菌和質(zhì)粒載體
        1.4 試驗所需溶液的配置
        1.5 主要試驗器材
        1.6 參考的基因序列
    2 方法
        2.1 HRM 在線模擬和引物設(shè)計
        2.2 血液、組織中病毒核酸的提取
        2.3 反轉(zhuǎn)錄和 PCR 擴增
            2.3.1 RNA 反轉(zhuǎn)錄
            2.3.2 PCR 擴增反應(yīng)
        2.4 目的片段的克隆
            2.4.1 PCR 產(chǎn)物的回收
            2.4.2 目的片段與 pMD-18T 克隆載體的連接
            2.4.3 TOP10 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.4.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            2.4.5 陽性菌落的篩選、鑒定
            2.4.6 重組質(zhì)粒的提取
        2.5 目的片段測序和序列分析
        2.6 CSFV 野毒株與疫苗株 HRM 分析
            2.6.1 野毒株與疫苗株 3′UTR 基因 HRM 溶解曲線分析
            2.6.2 特異性試驗分析
            2.6.3 敏感性試驗分析
            2.6.4 重復(fù)性試驗分析
            2.6.5 野毒株與疫苗株混合感染模擬
    3 結(jié)果與分析
        3.1 NS5B 和 3′UTR 區(qū)域 PCR 擴增結(jié)果
            3.1.1 NS5B 區(qū)域 PCR 擴增結(jié)果
            3.1.2 豬瘟 3′UTR 區(qū)域 PCR 擴增結(jié)果
        3.2 CSFV 測序序列和代表株的 NS5B 基因分析
            3.2.1 NS5B 基因相似性分析
            3.2.2 NS5B 基因遺傳進(jìn)化分析
        3.3 CSFV 3′UTR 基因部分序列的分析
        3.4 CSFV 病毒分離株與疫苗株 HRM 分析
            3.4.1 病毒分離株和疫苗株 HRM 鑒別分析
            3.4.2 PCR-HRM 敏感性分析
        3.5 CSFV 3′UTR 區(qū)特異序列 HRM 模擬分析
            3.5.1 參考株與實驗分離株模擬曲線分析
            3.5.2 HRM 動力模擬曲線分析
        3.6 野毒株與疫苗株混合感染模擬
    4 討論
        4.1 豬瘟分離株基因序列特征
        4.2 豬瘟野毒株與疫苗弱毒株的 HRM 鑒別
        4.3 豬瘟 HRM 模擬分析
        4.4 豬瘟野毒株與疫苗弱毒株混合感染分析
    5 結(jié)論
第三章 HRM 分析方法中不同核酸片段、染料和儀器的比較
    1 材料與方法
        1.1 試驗材料
            1.1.1 試驗試劑與樣品
            1.1.2 主要試驗器材
        1.2 RNA 病毒（CSFV 和 ALV）反轉(zhuǎn)錄
        1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.4 溶解曲線在線模擬
        1.5 不同擴增片段的 PCR-HRM 方法建立
        1.6 不同染料的 HRM 比較
        1.7 不同儀器之間的 HRM 比較
    2 結(jié)果與分析
        2.1 PCR 擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果
        2.2 核酸序列熔解曲線模擬結(jié)果
        2.3 不同染料和擴增片段對 HRM 結(jié)果的影響
        2.4 不同儀器對 HRM 結(jié)果的影響
    3 討論
        3.1 不同擴增片段對 HRM 分析的影響
        3.2 不同核酸染料對 HRM 分析的影響
        3.3 不同儀器對 HRM 分析影響
    4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3117319