瘤胃尿素分解菌分泌的脲酶可以水解尿素為氨,氨可被微生物吸收利用,合成微生物蛋白,所以尿素分解菌在尿素氮循環(huán)中發(fā)揮關(guān)鍵作用�；隗w外培養(yǎng)和以gDNA為靶標(biāo)的測(cè)序技術(shù)已經(jīng)對(duì)瘤胃尿素分解菌群多樣性進(jìn)行了探究,但是,這些結(jié)果僅解決了瘤胃中存在哪些尿素分解菌的問(wèn)題,而沒(méi)有闡明正在發(fā)揮功能的活性尿素分解菌群及其多樣性。本研究的目的是基于RNA測(cè)序揭示瘤胃中具有活性的尿素分解菌群多樣性。為了從瘤胃微生物中提取高質(zhì)量的RNA,本研究對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)共優(yōu)化四個(gè)前處理?xiàng)l件:瘤胃液樣品形式、樣品保存形式、解凍處理和研磨溫度,組合形成五個(gè)處理組:（1）微生物菌體加RNA保護(hù)液液氮冷凍研磨、（2）微生物菌體液氮保存液氮冷凍研磨、（3）微生物菌體液氮保存常溫研磨、（4）瘤胃內(nèi)容物液氮保存液氮冷凍研磨、（5）瘤胃內(nèi)容物液氮保存解凍收集菌體液氮冷凍研磨。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),檢測(cè)RNA濃度和完整度（RIN）。結(jié)果表明,瘤胃液樣品形式對(duì)RNA濃度和RIN差異不顯著;液氮保存的樣品提取的RNA濃度和RIN均顯著高于RNA保護(hù)液保存的樣品;解凍處理對(duì)RNA濃度差異不顯著,但是會(huì)降低RIN;研磨溫度對(duì)RIN沒(méi)有顯... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

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胃腸道擴(kuò)增子測(cè)序研究程序Fig1Gastrointestinalampliconsequencingprogram利用擴(kuò)增子測(cè)序的方法，已對(duì)瘤胃微生物功能基因信息有了新的認(rèn)識(shí)

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章瘤胃微生物RNA提取中樣品前處理方法的優(yōu)化10濃度影響有顯著差異（P<0.05）。對(duì)比處理組D和E，說(shuō)明解凍處理對(duì)RNA濃度影響沒(méi)有顯著差異。對(duì)比處理組B和C，瘤胃菌體在常溫環(huán)境下研磨得到的RNA的濃度為418.67ng/μL。冷凍研磨比常溫研磨提取RNA濃度高46.6%，顯著高于在常溫研磨的方法（P<0.05）。研磨溫度對(duì)RNA濃度影響有顯著差異。2.2.2總RNA完整度對(duì)比處理組B和E，液氮環(huán)境下冷凍研磨破碎瘤胃菌體和瘤胃內(nèi)容物，總RNARIN值分別為8.4和9.4，差異不顯著（P>0.05）（圖2）。處理瘤胃液樣品形式對(duì)RNA完整度影響差異不顯著。對(duì)比處理組A和B，添加RNA保護(hù)液提取總RNARIN值為2.8。液氮保存的樣品提取RNA完整度極顯著高于液氮保存的樣品（P<0.05）。處理保存形式對(duì)RNA完整度影響有極顯著。對(duì)比處理組D和E，解凍后收集菌體提取RNARIN值為5.5。不解凍處理所提取的RNA完整度（P<0.05）顯著高于解凍處理，解凍處理對(duì)RNA完整度影響有顯著差異。對(duì)比處理組B和C，分別在常溫和液氮環(huán)境下破碎瘤胃菌體，RNARIN值分別為8.4和8.3，差異不顯著（P>0.05），研磨溫度對(duì)RNA完整度影響差異不顯著。圖2瘤胃液不同前處理?xiàng)l件對(duì)總RNA濃度的影響Fig.2EffectofdifferentpretreatmentconditionsontotalRNAconcentrationA微生物菌體加入RNA保護(hù)液冷凍研磨B微生物菌體液氮保存冷凍研磨C微生物菌體液氮保存常溫研磨D瘤胃內(nèi)容物液氮保存解凍后收集菌體冷凍研磨E瘤胃內(nèi)容物液氮保存冷凍研磨，a-c字母不同表示差異顯著（P<0.05）AFreezehomogenizationofBacteriawithRNAProtectiveSolutionBFreezehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenCRoomtemperaturehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenDLiquidnitrogenandhomogenizationofrum

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章瘤胃微生物RNA提取中樣品前處理方法的優(yōu)化11圖3瘤胃液不同前處理?xiàng)l件對(duì)總RNA完整度的影響Fig.3EffectsofdifferentpretreatmentconditionsontheintegrityoftotalRNAA微生物菌體加入RNA保護(hù)液冷凍研磨B微生物菌體液氮保存冷凍研磨C微生物菌體液氮保存常溫研磨D瘤胃內(nèi)容物液氮保存解凍后收集菌體冷凍研磨E瘤胃內(nèi)容物液氮保存冷凍研磨，a-d字母不同表示差異顯著（P<0.05）AFreezehomogenizationofBacteriawithRNAProtectiveSolutionBFreezehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenCRoomtemperaturehomogenizationofBacteriawithliquidnitrogenDLiquidnitrogenandhomogenizationofrumencontentsafterliquidnitrogenstorageandthawingEFreezehomogenizationofrumencontentswithliquidnitrogen,Significantdifferenceindifferentrepresentationsofa-dletters（P<0.05）2.3討論濃度和RIN是評(píng)價(jià)RNA的兩個(gè)重要指標(biāo)。RIN值用來(lái)評(píng)估RNA的完整性，它是由核糖體條帶的比值和RNA樣品的整個(gè)電泳軌跡決定的(SCHROEDERetal.,2006)。RIN值為10表示一個(gè)完整的RNA樣本，RIN值大于8的樣本符合轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建要求，可進(jìn)行下游試驗(yàn)(LIetal.,2012)。環(huán)境或胃腸道樣品的RNA很容易被RNA酶降解，它的提取是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。RNA酶廣泛而穩(wěn)定存在，耐受多種處理而不被滅活，如煮沸，高壓滅菌。在實(shí)驗(yàn)中，要嚴(yán)格控制外源RNA酶的污染，同時(shí)也要最大限度的抑制內(nèi)源性RNA酶。本研究描述了不同的瘤胃液前處理方法對(duì)提取RNA濃度與完整度的影響，找到了一種分離提取高質(zhì)量、高代表性的瘤胃微生物RNA的快速有效方法。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)收集瘤胃內(nèi)容物或瘤胃微生物菌體得到的RNA濃度和完整度都沒(méi)有顯著差異。但是采集瘤胃微生物菌體需要采樣現(xiàn)場(chǎng)配置


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