Piwi （P-element induced wimpy testis）基因參與生殖干細(xì)胞自我更新、減數(shù)分裂、RNA沉默以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。在模式生物上,研究發(fā)現(xiàn)piRNAs （Piwi-interacting RNAs）介導(dǎo)PIWI蛋白的表觀遺傳調(diào)控和轉(zhuǎn)錄初水平調(diào)控過程是生殖干細(xì)胞維持、配子形成以及受精的關(guān)鍵因素,但有關(guān)家禽Piwi基因的研究報(bào)道甚少。PIWI蛋白雖然廣泛存在于各種動(dòng)物中,但大部分只局限在配子發(fā)生和胚胎發(fā)育早期表達(dá),而且表達(dá)模式也不一致,影響了其對(duì)生殖過程的具體作用機(jī)制的探討。就此而言,禽類配子、胚胎易于獲取且便于人工操作,具有其他生物無可比擬的優(yōu)越性,可為探討PIWI蛋白如何發(fā)揮調(diào)控作用的具體機(jī)制提供研究平臺(tái)。另外,作為人類主要的動(dòng)物蛋白來源食品,家禽業(yè)生產(chǎn)正處于發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期,仍有不少問題亟待解決：一是繁殖力持續(xù)下降,商業(yè)品種中每年有5～12%的無精癥雞遭淘汰；二是如禽流感、白血病等一些RNA病毒,因其容易變異造成預(yù)防、治療失敗,給家禽產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的損失。本研究以中國(guó)地方雞種——狼山雞為研究對(duì)象,分別從基因克隆、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和功能抑制等4個(gè)方面對(duì)Piwi ... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：131 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
目錄
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 Piwi基因的研究進(jìn)展
        1.1 Argonaute蛋白家族
        1.2 Piwi基因的發(fā)現(xiàn)
        1.3 Piwi基因的生物學(xué)功能
        1.4 PIWI蛋白與非編碼小RNA
    2 雞基因組轉(zhuǎn)座子概述
    3 禽類精子發(fā)生
        3.1 禽類的生殖器官
        3.2 精子發(fā)生
    4 真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
        4.1 真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件
        4.2 真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
    5 RNA干擾技術(shù)
        5.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
        5.2 RNAi的作用機(jī)制
        5.3 RNAi技術(shù)
    6 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)
        6.1 Real-Time qPCR的幾個(gè)常用術(shù)語
        6.2 Real-Time qPCR的檢測(cè)方法
        6.3 Real-Time qPCR的數(shù)據(jù)分析方法
    7 本研究的目的和意義
第二章 雞Piwil1基因的克隆及其時(shí)空表達(dá)分析
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 主要儀器
        2.3 主要試劑
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 樣品采集與保存
        3.2 雞原始生殖細(xì)胞（PGCs）的分離與鑒定
        3.3 雞精原干細(xì)胞（SSCs）的分離與鑒定
        3.4 雞睪丸生精細(xì)胞的分離與鑒定
        3.5 雞成熟精子的純化
        3.6 基因組DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)
        3.7 性別鑒定
        3.8 總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)
        3.9 RT-PCR
        3.10 TA克隆
        3.11 RACE
        3.12 Real-Time qPCR
        3.13 生物信息學(xué)分析
        3.14 數(shù)據(jù)分析
    4 結(jié)果與分析
        4.1 雞PGCs的鑒定結(jié)果
        4.2 雞SSCs的鑒定結(jié)果
        4.3 雞睪丸精原（母）細(xì)胞的鑒定結(jié)果
        4.4 雞Piwil1基因的克隆及其生物信息學(xué)分析
        4.5 雞Piwil1基因的組織、細(xì)胞表達(dá)特異性
        4.6 Piwil1基因在狼山雞不同發(fā)育階段不同組織的表達(dá)量分析
        4.7 Piwil1基因在狼山雞胚胎期性腺組織中的表達(dá)量分析
    5 討論
第三章 雞Piwil1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 主要儀器
        2.3 主要試劑
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 基因組DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)
        3.2 Piwil1基因啟動(dòng)子區(qū)系列缺失片段的擴(kuò)增
        3.3 克隆測(cè)序
        3.4 Piwil1基因啟動(dòng)子區(qū)系列缺失片段表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.5 定點(diǎn)突變表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.6 無內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取
        3.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.8 熒光素酶活性檢測(cè)
        3.9 數(shù)據(jù)處理
    4 結(jié)果與分析
        4.1 Piwil1基因啟動(dòng)子區(qū)系列缺失片段表達(dá)載體的鑒定
        4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
        4.3 Piwil1基因啟動(dòng)子活性分析
        4.4 CCAAT box和TCCC box轉(zhuǎn)錄元件的定點(diǎn)突變分析
    5 討論
第四章 體外抑制雞Piwil1基因的表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)座子活性的影響
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 主要儀器
        2.3 主要試劑
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 pcDNA3.1（+）-Piwil1表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2 Piwil1基因shRNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3 Piwil1基因miRNA干擾慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.4 無內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取
        3.5 慢病毒包裝
        3.6 慢病毒滴度測(cè)定
        3.7 miRNA干擾質(zhì)粒和高表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞
        3.8 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及慢病毒侵染HEK293細(xì)胞
        3.9 shRNA干擾質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染雞PGCs細(xì)胞
        3.10 Western Blot檢測(cè)
        3.11 細(xì)胞間接免疫熒光檢測(cè)
        3.12 Real-Time qPCR
        3.13 數(shù)據(jù)分析
    4 結(jié)果與分析
        4.1 pcDNA3.1（+）-Piwil1表達(dá)載體的鑒定
        4.2 PIWIL1蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)
        4.3 miRNA干擾表達(dá)載體干擾效果的篩選
        4.4 慢病毒包裝與滴度測(cè)定
        4.5 慢病毒干擾效果的初步驗(yàn)證
        4.6 體外抑制雞Piwil1基因的表達(dá)對(duì)CR1轉(zhuǎn)座子活性的影響
    5 討論
第五章 鵪鶉Piwil1基因克隆和piRNAs的表達(dá)譜研究
    1 引言
    2 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.2 主要儀器
        2.3 主要試劑
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 樣品采集與保存
        3.2 總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)
        3.3 RT-PCR
        3.4 RACE
        3.5 Northern Blot檢測(cè)
        3.6 Western Blot檢測(cè)
        3.7 免疫沉淀反應(yīng)
        3.8 Small RNA cDNA文庫的制備與Solexa測(cè)序
        3.9 生物信息學(xué)分析
    4 結(jié)果與分析
        4.1 鵪鶉Piwil1基因的克隆與生物信息學(xué)分析
        4.2 鵪鶉Piwil1基因的組織表達(dá)特異性
        4.3 Small RNAs深度測(cè)序數(shù)據(jù)概述
        4.4 piRNAs比對(duì)分析
    5 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]雞肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子活性分析[J]. 高廣亮,冷麗,張會(huì)豐,賀綦,李輝,王啟貴.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(09)
[2]鴨CD8α基因啟動(dòng)子的分析及其轉(zhuǎn)錄活性[J]. 徐琪,陳陽,黃正洋,張揚(yáng),陳昌義,趙榮雪,李秀,段修軍,陳國(guó)宏.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(12)
[3]雞pilRNAs分子的克隆及表達(dá)規(guī)律分析[J]. 張穎,常國(guó)斌,陳蓉,戴愛琴,欒德琴,李建超,馬騰,華登科,陳國(guó)宏.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(06)
[4]梅嶺土雞原始生殖細(xì)胞的生物學(xué)特性[J]. 王燕麗,郝柱,李艷玲,彭靜,沈一飛,袁肖笑,王穎,徐寧迎.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2012(04)
[5]鵝PIT-1基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究[J]. 趙榮雪,趙文明,徐琪,段修軍,董飚,孫國(guó)波,畢瑜林,李秀,張揚(yáng),黃正洋,陳國(guó)宏.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(02)
[6]鵪鶉piRNAs和Piwil1基因克隆及表達(dá)研究[J]. 陳蓉,常國(guó)斌,張穎,陳國(guó)宏,胡國(guó)順,欒德琴,劉艷,戴愛琴.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(08)
[7]雞脂蛋白酯酶基因啟動(dòng)子的克隆及活性分析[J]. 畢靜,丁寧,王寧,李輝.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(06)
[8]啟動(dòng)子序列克隆和功能分析方法的研究進(jìn)展[J]. 楊曉娜,趙昶靈,李云,李會(huì)容,蘇麗,周燕瓊.  云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2010(02)
[9]家雞CHD1基因PCR快速性別鑒定方法的建立及其在早期雞胚中的應(yīng)用[J]. 王嘉力,賈存靈,蘇利紅,魏澤輝.  家禽科學(xué). 2009(12)
[10]PIWIL1在不同腫瘤細(xì)胞中的差異性表達(dá)[J]. 田瑞卿,劉民,李欣,湯華.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2008(11)



本文編號(hào)：3110640