糞腸球菌Enterococcus faecalis)是人、動物等腸道內(nèi)生存的正常的微生物菌群；然而,在多數(shù)的臨床分離菌中普遍存在有致病島（PAIs）,且與健康腸道分離菌株有非常大的差異。研究表明多數(shù)的毒力基因與抗藥基因可能由可移動元件攜帶,如何抑制這些移動元件的水平轉(zhuǎn)移成為當前首要任務(wù)。聚集規(guī)律間隔的短回文重復序列（CRISPR位點）是在細菌長期的進化和適應過程中所形成的,作為抵御外源基因入侵的一種自我保護機制。主要是利用CRISPR/Cas系統(tǒng)所形組成的免疫體系,產(chǎn)生針對噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA的抑制作用,迫使致病基因及抗藥基因轉(zhuǎn)移失敗,從而保護宿主基因組的完整性。本實驗研究CRISPR/cas基因在大腸桿菌中的功能完整性,即其對外源DNA的抑制作用。通過特異性PCR擴增,發(fā)現(xiàn)在本實驗室保存的42株臨床分離E.faecalis中有11.90%的菌株含有完整的CRISPR/cas基因。經(jīng)過測序分析發(fā)現(xiàn)此片段共有7919bp,其中相鄰的四個cas基因與對應序列同源性達99.4%,并在重復區(qū)發(fā)現(xiàn)有13個間區(qū)序列存在,且重復序列具有明顯的頸環(huán)結(jié)構(gòu),而L序列相對于參考序列則有一個堿基突變,表明... 

【文章來源】：湖南農(nóng)業(yè)大學湖南省

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
目錄
1 前言
    1.1 糞腸球菌概述
    1.2 原核細胞中CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫機制
    1.3 研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料及儀器設(shè)備
    2.2 試驗方法
    2.3 糞腸球菌中CRISPR位點的檢測及分析
    2.4 CRISPR/cas位點全長序列的克隆
    2.5 CRISPR/cas位點克隆序列分析
1）質(zhì)粒構(gòu)建">    2.6 間區(qū)序列（S₁）質(zhì)粒構(gòu)建
    2.7 間區(qū)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化pCRISPR1-DH5α和pUC18-DH5α檢驗CRISPR1位點的功能
    2.8 噬菌體侵染重組大腸桿菌
3 結(jié)果與分析
    3.1 CRISPR1位點的驗證
    3.2 CRISPR1/cas位點全長序列的克隆
    3.3 CRISPR1/cas序列信息學淺析
1構(gòu)建及鑒定">    3.4 間區(qū)序列載體pET28-S₁構(gòu)建及鑒定
    3.5 CRISPR1/Cas系統(tǒng)機能檢驗結(jié)果
    3.6 噬菌體侵染重組大腸桿菌
4 討論
    4.1 CRISPR1/cas位點及其在糞腸球菌中的檢測
    4.2 CRISPR1/cas基因的克隆
    4.3 重組菌對間區(qū)重組質(zhì)粒免疫作用
    4.4 CRISPR1/Cas介導的獲得性抗噬菌體免疫
5 結(jié)論
參考文獻
附錄
符號說明
致謝
作者簡歷



本文編號：3105097