為了探討是否可以利用Pax7基因誘導綿羊間充質(zhì)細胞為成肌細胞,試驗采用RT-PCR技術(shù)從綿羊肌肉中成功克隆Pax7基因的編碼區(qū)序列（CDS）后,將其連接到酶切后的空表達載體pTetOn3-DsRed上,構(gòu)建誘導型慢病毒示蹤載體pTetOn3-DsRed-Pax7。通過脂質(zhì)體法將誘導型慢病毒示蹤載體pTetOn3-DsRed-Pax7與輔助包裝載體VSV-G、px和pMD共轉(zhuǎn)染到293T細胞中,獲得病毒上清液后侵染293T細胞,利用Western-blot技術(shù)檢測侵染后細胞中Pax7基因的表達情況,驗證所構(gòu)建載體的有效性及Pax7基因的表達活性。結(jié)果表明:試驗成功克隆得到綿羊Pax7基因的CDS及構(gòu)建出誘導型慢病毒示蹤載體pTetOn3-DsRed-Pax7;病毒侵染后,靶細胞經(jīng)綠光（532 nm）照射可表達紅色熒光;與空白對照細胞中Pax7基因的表達量相比,侵染誘導型慢病毒示蹤載體pTetOn3-DsRed-Pax7的293T細胞中Pax7基因的表達量明顯上升,且加入誘導物強力霉素后Pax7基因表達量顯著高于未添加強力霉素的細胞。說明試驗已成功構(gòu)建出特異性表達綿羊Pax7基因的誘導型慢... 

【文章來源】：黑龍江畜牧獸醫(yī). 2020,(19)北大核心

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

Pax7基因的PCR擴增結(jié)果

將回收得到的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T連接,用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ雙酶切后,在約2 600 bp和1 600 bp處出現(xiàn)目的條帶,見圖2。說明目的基因Pax7已與克隆載體pMD18-T連接,重組克隆載體pMD18-T-Pax7構(gòu)建成功。2.2 誘導型慢病毒示蹤載體pTetOn3-DsRed-Pax7的構(gòu)建與鑒定

使用含有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點的引物(Pax7-F2、Pax7-R2)對重組克隆載體pMD18-T-Pax7進行PCR擴增,并用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對空表達載體pTetOn3-DsRed進行酶切,回收目的片段并進行連接,構(gòu)建誘導型慢病毒示蹤載體pTetOn3-DsRed-Pax7,對其進行PCR擴增,結(jié)果在約1 600 bp處出現(xiàn)特異性條帶,見圖3。對誘導型慢病毒示蹤載體pTetOn3-DsRed-Pax7進行雙酶切鑒定,結(jié)果出現(xiàn)2條條帶,見圖4。圖4 誘導型慢病毒示蹤載體pTetOn3-DsRed-Pax7

【參考文獻】：
期刊論文
[1]草魚PAX7基因的克隆、序列分析及組織表達[J]. 甘甜,冷向軍,郭婷,胡靜,魏靜,李小勤.  生物技術(shù)通報. 2014(11)



本文編號：3088850