牛支原體（Mycoplasma bovis）是牛的一種重要致病性支原體,可導(dǎo)致牛肺炎、乳房炎等一系列疾病。丙酮酸脫氫酶E1是生命體進行糖酵解的關(guān)鍵酶,而目前牛支原體丙酮酸脫氫酶E1的生物學(xué)功能研究,以及其是否可以作為牛支原體病診斷靶標(biāo)的報道并不多見。本論文開展了牛支原體丙酮酸脫氫酶E1的克隆表達、單克隆抗體制備及其初步的生物學(xué)功能研究。本研究以PCR擴增獲得pdhα和pdhβ基因,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對pdhα和pdhβ基因序列進行初步分析;構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-pdhα和pET-pdhβ,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達重組融合蛋白,應(yīng)用Western blot及ELISA對E1?亞基和E1β亞基在細胞內(nèi)的分布進行了初步研究;重組融合蛋白rPDHA免疫小鼠制備免疫脾細胞,與小鼠骨髓瘤細胞融合,間接ELISA檢測能分泌預(yù)定抗體的陽性雜交瘤細胞并進行亞克隆篩選,同時對單克隆抗體的效價和反應(yīng)特異性進行檢測;利用帶有GFP標(biāo)簽的E.coli-pdhα-gfp、E.coli-pdhβ-gfp表達菌感染NBL-4細胞,置于熒光顯微鏡觀察黏附情況。結(jié)果顯示:①pdhα與pdhβ基因序列與其他已報道的相關(guān)序列具有... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Summary
外文縮略語表
第一章 文獻綜述
    1 牛支原體及其致病機理和診斷研究進展
        1.1 牛支原體
        1.2 牛支原體致病機理
        1.3 牛支原體相關(guān)疾病的診斷
            1.3.1 病原學(xué)診斷
            1.3.2 血清學(xué)診斷
            1.3.3 分子生物學(xué)診斷
    2 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體及其生物學(xué)功能
        2.1 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的結(jié)構(gòu)組成
        2.2 丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的催化作用機理
        2.3 丙酮酸脫氫酶E1的結(jié)構(gòu)及功能特性
        2.4 丙酮酸脫氫酶在支原體的相關(guān)研究
    4 本研究的目的意義
第二章 牛支原體PDH E1亞基基因的克隆及相關(guān)信息分析
    1 材料
        1.1 菌種及載體
        1.2 儀器
        1.3 試劑
            1.3.1 主要試劑
            1.3.2 試劑配制
            1.3.3 培養(yǎng)基配制
    2 方法
        2.1 牛支原體基因組的粗提
        2.2 pdhα 和pdhβ 基因的擴增及優(yōu)化
        2.3 目的基因序列相似性及抗原表位初步預(yù)測
    3 結(jié)果
        3.1 pdhα 和pdhβ 基因的擴增及序列分析
        3.2 pdhα 和pdhβ 基因序列相似性分析結(jié)果
        3.3 E1α、E1β 亞基抗原表位初步預(yù)測結(jié)果
    4 討論
第三章 牛支原體PDH E1亞基基因原核表達及亞細胞定位
    1 材料
        1.1 菌種、載體及試驗動物
        1.2 儀器
        1.3 試劑
            1.3.1 主要試劑
            1.3.2 試劑配制
    2 方法
        2.1 原核表達載體的構(gòu)建
        2.2 融合蛋白的誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE分析
        2.3 多克隆抗體的制備
        2.4 膜蛋白提取
        2.5 E1a、β 亞基在牛支原體細胞內(nèi)的分布
            2.5.1 Western-blot分析
            2.5.2 ELISA檢測
    3 結(jié)果
        3.1 原核表達質(zhì)粒p ET-pdhα、p ET-pdhβ 的酶切鑒定
        3.2 r PDHA及r PDHB的誘導(dǎo)表達
        3.3 E1a、β 亞基在牛支原體細胞內(nèi)的分布
    4 討論
第四章 牛支原體丙酮酸脫氫酶E1α 亞基單克隆抗體的制備
    1 材料
        1.1 試驗動物、菌株、細胞及抗原
        1.2 儀器
        1.3 主要試劑
    2 方法
        2.1 BALB/c小鼠的免疫
        2.2 骨髓瘤細胞的培養(yǎng)
        2.3 飼養(yǎng)細胞的制備
        2.4 小鼠免疫脾細胞的制備
        2.5 確定最佳抗原包被量
        2.6 骨髓瘤細胞和免疫脾細胞的融合
        2.7 雜交瘤細胞的抗體檢測
        2.8 陽性雜交瘤細胞亞克隆篩選
        2.9 雜交瘤細胞的凍存與復(fù)蘇
        2.10 單克隆抗體效價檢測
        2.11 單克隆抗體特異性檢測
        2.12 雜交瘤細胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測
    3 結(jié)果
        3.1 牛支原體抗原最佳包被濃度的確定
        3.2 細胞融合前小鼠尾血效價
        3.3 雜交瘤細胞株的建立
        3.4 單克隆抗體的生物學(xué)活性
            3.4.1 單克隆抗體效價
            3.4.2 單克隆抗體特異性
        3.5 雜交瘤細胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測
    4 討論
第五章 牛支原體丙酮酸脫氫酶E1亞基的黏附特性研究
    1 材料
        1.1 菌株、載體與細胞
        1.2 試劑
    2 方法
        2.1 熒光表達載體的構(gòu)建
        2.2 重組菌的誘導(dǎo)表達
        2.3 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp對NBL-4 細胞的黏附試驗
        2.4 E. coli-pdhα-gfp和E. coli-pdhβ-gfp對NBL-4 細胞的黏附抑制試驗
    3 結(jié)果
        3.1 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.2 重組菌的誘導(dǎo)表達
        3.3 E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp對NBL-4 細胞的黏附試驗
        3.4 多抗血清對E. coli-pdhα-gfp、E. coli-pdhβ-gfp的黏附抑制試驗
    4 討論
全文結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介
導(dǎo)師簡介


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]山羊支原體山羊肺炎亞種單克隆抗體的制備及抗體結(jié)合抗原表位的篩選[J]. 鄭瑩瑩,駢亞亞,儲岳峰,趙萍,賀英,簡瑩娜,姜永強,逯忠新.  中國畜牧獸醫(yī). 2014(08)
[3]雞毒支原體丙酮酸脫氫酶E1β亞基單克隆抗體的制備和鑒定[J]. 張凡慶,譚磊,包世俊,任峰,陸鳳,費榮梅,丁鏟.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2014(07)
[4]牛支原體單克隆抗體的制備與鑒定[J]. 任澤民,姜勇,巴曉亮,胡長敏,陳穎鈺,彭清潔,陳煥春,郭愛珍.  中國畜牧獸醫(yī). 2012(07)
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博士論文
[1]滑液支原體膜表面丙酮酸脫羧酶的生物學(xué)特性研究[D]. 包世俊.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014

碩士論文
[1]牛支原體p28基因的表達及間接ELISA方法的建立[D]. 劉洋.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2011



本文編號：3085048