摘要：在真核生物中,DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)重要的修飾方式之一,對基因的表達(dá)具有調(diào)控作用,研究表明：DNA甲基化在動物生長和組織發(fā)育分化中具有重要作用。本研究以17周齡北京油雞肌肉和卵巢組織為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用甲基化敏感擴(kuò)增片段多態(tài)性（Methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP）方法檢測2個組織基因組DNA甲基化程度,通過毛細(xì)管電泳結(jié)果優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件,開發(fā)了MSAP熒光檢測數(shù)據(jù)的自動分析軟件,對北京油雞肌肉和卵巢組織及不同體重組間基因組DNA甲基化水平差異進(jìn)行研究。結(jié)果如下：1、采用毛細(xì)管電泳熒光檢測技術(shù)分析MSAP選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物,通過對基因組DNA用量、預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù)、選擇性引物濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、電泳DNA量、內(nèi)標(biāo)量和進(jìn)樣時間等8個主要參數(shù)進(jìn)行分析和優(yōu)化,優(yōu)化了用于北京油雞基因組DNA甲基化分析的MSAP毛細(xì)管電泳熒光檢測體系。2、應(yīng)用MSAP方法檢測北京油雞肌肉組織基因組DNA甲基化水平。對獲得的MSAP熒光檢測初始數(shù)據(jù)分別應(yīng)用直接取整法、整區(qū)間放置法和半?yún)^(qū)間放置法等三種自動處理方法進(jìn)行分析并比較。結(jié)果顯示... 

【文章來源】：北京交通大學(xué)北京市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖譜

預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10倍后作為模板，應(yīng)用12對選擇性擴(kuò)增引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增反應(yīng)�；蚪MDNA、雙酶切、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增結(jié)果如圖26所示。M arker 12 3 4H M H M H M H M圖26北京油雞肌肉組織MSAP瓊脂糖電泳檢測結(jié)果A：基因組DNA提取結(jié)果；B:酶切反應(yīng)結(jié)果；C:預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果；D:選擇性擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果。Marker: DL2000; H： //pall/^^croR I 雙酶切產(chǎn)物；M: Afe/? I /及roR I 雙酶切產(chǎn)物；1、2:高體重組肌肉組織，3、4:低體重組肌肉組織。Fig.26 MSAP agarose electrophoresis test results of Beijing You chicken muscle tissueA: Genomic DNA extracted from Beijing You chicken tissues; B: genomic DNA digested withrestriction enzyme; C: result of pre-amplification; D: result of selective amplification. Marker:DL2000; H: digested by Hpa II fEcoR I，M: digested by Msp I /EcoR I ； 1,2: muscles from highweight group; 3，4: muscles from low weight group.i 41

將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Excel表格數(shù)據(jù)，PAGE電泳圖譜、內(nèi)標(biāo)圖譜、焚光圖譜和對應(yīng)的Excel表格數(shù)據(jù)如圖27所示：r‘^ wWtSt 出卜 I ;2 0 0I 二二二 氣 ；^ H I :: H I : " 3_so.s-si.ssia3 m.sr';、 / M 媒rj 4,th$-SZS 0 0“、* — f ‘ ."■iT: - ^ :j : i ^ $ S2.s-sxs 0 0O. M I *? V-JS?慈X~ >f"、 K. ￠: 補(bǔ)》?>,.:>“》 . §.**"各4 ^ 寒，》g!S 分i，謂!“:::；. ： ： 1: I-jM i ： 1 ;■ IQ, 57.5-68. S ST. 8 S7. T?? - ?嗜. ■ I " i ?； ！ 11； ? M U 58.5-59.5 0 "ti 一 -‘ 'f. AI “ ^ ‘ i., C n ,ss, s-w. $ ss. rs ? D?,.sa?::?as： :?-J I丄 ‘“4一 U,-“:..》.?13 60.5-SI.5, 0 』圖27電泳檢測結(jié)果及數(shù)據(jù)的導(dǎo)出A： MSAP銀染圖譜；B： GeneMapper4.0導(dǎo)出的內(nèi)標(biāo)焚光圖譜；B： GeneMapper 4.0導(dǎo)出的樣品焚光圖譜；D:原始數(shù)據(jù)經(jīng)軟件處理后結(jié)果。Fig.27 Results of electrophoresis detection and data obtained from MSAP samplesA: MSAP profiles using silver stain; B: Marker fluorescent print generated by GeneMapper 4.0; C:sample fluorescent print generated by GeneMapper 4.0; D: The raw data processing results bysoftware.3.4.3 DNA甲基化模式的分析在MSAP檢測技術(shù)中，應(yīng)用同裂酶HpaW/Msp I分別和五coR I組合對基因組DNA進(jìn)行雙酶切，同裂酶HpaII和Msp I能夠識別CCGG位點(diǎn)，但對位點(diǎn)中的甲基化程度敏感性不同，//;?all不能酶切雙鏈上的內(nèi)外側(cè)胞噴徒的甲基化及任一側(cè)胞噴唆甲基化狀態(tài)，即不能酶切含"CCGG、CrCGG和mcTCGG的位點(diǎn)。而Mp I可以識別單鏈或雙鏈上內(nèi)部胞嚼徒甲基化狀態(tài)


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