肌肉生長抑制素基因（MSTN）的突變可導(dǎo)致動(dòng)物肌肉的顯著增長，這一發(fā)現(xiàn)提示可以通過抑制該基因的表達(dá)提高動(dòng)物肌肉的產(chǎn)量。本研究旨在通過基因敲除的方式建立轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞系。首先，從蒙古牛肌肉組織中提取蒙古�；蚪MDNA，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到用于載體構(gòu)建的同源序列。其次，構(gòu)建基因打靶載體。同時(shí)，以組織塊貼壁法原代培養(yǎng)獲得蒙古牛胎兒皮膚成纖維細(xì)胞。將載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后經(jīng)正篩選，共獲得253個(gè)細(xì)胞克隆，將這些單克隆細(xì)胞提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定得到2個(gè)陽性克隆。與普通成纖維細(xì)胞相比，所得敲除MSTN基因的陽性細(xì)胞克隆在細(xì)胞形態(tài)、性狀及生長特性等方面均發(fā)生了極其顯著的變化，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大；邊界模糊，立體感降低；生長速率下降明顯；胰蛋白酶消化所需時(shí)間明顯增加。研究認(rèn)為，細(xì)胞形態(tài)和生長特性的改變可能受到轉(zhuǎn)染過程、經(jīng)過藥物篩選、長時(shí)間在體外培養(yǎng)的影響，也可能與MSTN基因的敲除有關(guān)。本研究為采用分子育種手段培養(yǎng)高產(chǎn)肉量蒙古牛奠定了一定的基礎(chǔ)。 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

載體結(jié)構(gòu)圖

PCR 反應(yīng)條件：94℃ 5min94℃ 30s50℃ 30s 25cycles72℃ 45s72℃ 10min4 ℃ ∞擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，核酸染料染色，上樣量為 5μL，100V電泳 30min。4 結(jié)果4.1 實(shí)驗(yàn)一 基因克隆以蒙古�；蚪M DNA 為模板，用引物 SF 和 SR 擴(kuò)增同源短臂 S，用引物 LF和 LR 擴(kuò)增同源長臂 L，PCR 鑒定見圖 2。1 2 3 4 5 1 2 3 4

A B圖 3 A：同源重組短臂和 T 載體連接后的 PCR 鑒定；B：同源重組長臂和 T 載體連接后的 PCR 鑒定Fig.3 PCR identification of homologous short arm（A）and homologous arm（B）注：圖 A 泳道 1-5 為 T+S菌落 1-5 的 PCR 產(chǎn)物，大小約 1000bp，泳道 6 為 MakerDL5000;圖 B 泳道 2-5 為T+L 菌落 1-4 的 PCR 產(chǎn)物，大小約 5000bp，泳道 1 為 M akerDL5000。4.2.2 同源重組片段與載體 pFPC-1 的連接用 XbaI 和 PmeI 酶切 T+S，用 ClaI 和 NotI 酶切 T+L 鑒定見圖 4。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]用綠色熒光蛋白和肝再生增強(qiáng)因子基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因綿羊胚胎的研究[D]. 馬玉珍.內(nèi)蒙古大學(xué) 2004

碩士論文
[1]絨山羊FGF5基因的序列分析及其敲除載體構(gòu)建[D]. 蘇少鋒.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3068719