牛傳染性鼻氣管炎（Infections bovine rhinotracheitis,IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infections bovine rhinotracheitis virus,IBRV）引起。一般情況下 IBRV 容易發(fā)生反復(fù)感染,導(dǎo)致本病難以清除,嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)。目前,疫苗免疫是防治IBR的主要措施,但滅活疫苗不能引起長期持續(xù)的體液免疫,弱毒疫苗有殘余毒力和返強(qiáng)等危險(xiǎn)。為了有效防控IBR,需要開發(fā)有效的診斷用抗體。本試驗(yàn)研究通過克隆IBRV gD基因,連接原核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),純化及鑒定,獲得IBRV-gD蛋白;然后以IBRV為抗原免疫成年健康雙峰駝,采集全血,提取淋巴細(xì)胞總RNA,將其反轉(zhuǎn)錄后,擴(kuò)增VHH基因片段并與載體pCANTAB5E連接,將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1感受態(tài)內(nèi),成功構(gòu)建IBRV VHH抗體庫。經(jīng)過鑒定IBRV抗體庫庫容為7×107。經(jīng)菌落鑒定,IBRV抗體庫轉(zhuǎn)化效率為75%。以gD蛋白作為篩選抗原,利用噬菌體展示技術(shù),從IBRV VHH抗體庫內(nèi)進(jìn)行篩選,并選取了相對(duì)結(jié)合能力較強(qiáng)的一株陽性克隆（IB68）,構(gòu)建表達(dá)載體... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?ｇＤ基因ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果??

圖２?ＩＢＲＶ?ｇＤ誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果??Ｆｉｇ?２?ＩＢＲＶ?ｇＤ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ??注：Ａ：?ＬａｎｃＭ：?Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｍａｒｋｅｒ，Ｌａｎｅｌ：末誘導(dǎo)的菌液，Ｌａｎｅ２：菌體破碎?ｈ清，Ｌａｎｃ３：菌沉淀，Ｌａｎｅ４：?ｇＤ蛋ｆｔ純化流穿液，Ｌａｎｅ５－６：?ｇＤ蛋白純化產(chǎn)物??Ｂ：?ＬａｎｅＭ：?Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ?ｐｒｏｔｏｉｎ?ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅｌ：?ｇＤ?蛋ｆｔ?Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ?條帶??２．?４討論??ＩＢＲ給全球的養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織曾將其列為Ｂ病，也是我國入境動(dòng)物必檢疫病之一。??雖然接種傳統(tǒng)疫苗，可以產(chǎn)生的免疫效果，控制發(fā)病，抑制病毒的復(fù)制和傳但是，ｆｆｉＲＶ并不能徹底的被機(jī)體免疫力清除，而是轉(zhuǎn)為隱形感染。盡管如此，撲殺的成本太高，接種疫苗還是大部分國家防控的主要措施［５〇］。ＩＢＲＶ感染后癥明顯，只能通過實(shí)驗(yàn)室檢測確診，而血清學(xué)檢測和病毒的分離鑒定等方法耗時(shí)長，受不確定因素影響，不能滿足實(shí)際情況中準(zhǔn)確快速的檢疫要求，因此迫切需要開。Ｄ，Ｄ

以胳駝外周血淋巴細(xì)胞提取的總ＲＮＡ反轉(zhuǎn)錄合成的ｃＤＮＡ為模板，利用特異性??引物，通過兩輪ＰＣＲ反應(yīng)獲得ＶＨＨ基因。第一輪ＰＣＲ獲得抗體前導(dǎo)肽至ＣＨ２區(qū)基??因序列，大小在７００?ｂｐ左右，如圖３?Ａ所示。第二輪ＰＣＲ獲得ＶＨＨ基因ＦＲ１－ＦＲ４??全長基因，片段大小為４００?ｂｐ左右，如圖３?Ｂ所示。??Ａ?Ｂ??（ｂｐ）?Ｍ?１?２?３?４?５?（ｂｐ）?Ｍ?１?２??１?歷三??圖３?ＩＢＲＶ?ＶＨＨ基因ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果??Ｆｉｇ．?３?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ＩＢＲＶ?ＶＨＨ?ｇｅｎｅ??注：Ａ：?ｌａｎｅＭ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?ｌａｎｅ卜５：?ＶｌＩＩＩ?基因一輪擴(kuò)增??Ｂ：?ｌａｎｅＭ：?ＤＬ２０００?Ｍａｒｋｅｒ，?ｌａｎｅ卜２：?ＶＨＨ?基因—輪擴(kuò)增??３．?３．?２駱駝血清ＥＬＩＳＡ檢測抗體效價(jià)結(jié)果??以ＩＢＲＶ包被９６孔板，將駱駝經(jīng)４次免疫后采集血清，倍比稀釋，并以基礎(chǔ)血??清為陰性對(duì)照，進(jìn)行ＥＬＩＳＡ血清抗體效價(jià)測定。結(jié)果如圖４所示：駱駝血清抗ＩＢＲＶ??抗體效價(jià)達(dá)到ｈ?４０９６。??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[7]IBRV XA株的分離鑒定及其gD蛋白的原核表達(dá)[D]. 李河林.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2010
[8]牛傳染性鼻氣管炎病毒抗體間接ELISA的建立及其在流行病學(xué)研究中的應(yīng)用[D]. 顏邦芬.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
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