H9N2亞型禽流感病毒HA和NP蛋白單克隆抗體的制備及在抗原變異分析中的初步應(yīng)用
發(fā)布時(shí)間：2021-03-06 18:35
H9N2亞型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）自首次分離至今,已在全世界各地造成了廣泛的傳播。在國內(nèi),H9N2亞型AIV呈地方性流行且傳播范圍廣,不但給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,也給公共衛(wèi)生安全造成潛在的威脅。在免疫壓力和抗原漂移作用下,AIV容易發(fā)生抗原變異,最終導(dǎo)致免疫失敗。因此研發(fā)針對(duì)H9N2亞型AIV較為理想的單抗對(duì)H9亞型AIV監(jiān)測和診斷有重要的意義。1.H9N2亞型禽流感病毒HA和NP基因的克隆及表達(dá)選取 H9N2 AIV 流行株 A/Chicken/Taixing/10/2010（簡稱 rTX）和疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98（簡稱F98）作為研究對(duì)象,通過PCR分別擴(kuò)增其HA基因和NP基因,將其克隆到真核表達(dá)載體PCAGGS上,成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒PCAGGS-rTX-HA、PCAGGS-F98-HA 和 PCAGGS-rTX-NP。然后將其轉(zhuǎn)染入 293T 細(xì)胞,通過間接免疫熒光試驗(yàn)（Indirect immunofluorescence assay,IFA）和蛋白印跡試驗(yàn)（Western blot,WB）檢測確定HA...
【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省
【文章頁數(shù)】：80 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
圖１流感病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)（引自張劍２０１６）??Ｆｉｇ?１?．Ｐａｒｔｉｃｌｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｉｎｆｌｕｅｎｚａ?ｖｉｒｕｓ??
?第一章Ｈ９Ｎ２亞型禽流感病毒ＨＡ和ＮＰ基因克隆及表達(dá)???以毒株ｒＴＸ和Ｆ９８的ｃＤＮＡ為模版，用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)増，ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１?％??瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)果如圖１－１和圖１－２所示，擴(kuò)增出大約１７００?ｂｐ左右的??ＨＡ片段和１５００?ｂｐ左右ＮＰ片段，結(jié)果與預(yù)期相符。??Ｍ?１?２??２０００ｂｐ?—??ｉ?ＯＯＯｂｐ?——??圖１－１?ＨＡ片段的ＰＣＲ擴(kuò)增圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ?毒株的?ＨＡ?片段；２：?Ｆ９８?毒株的?ＨＡ?片段；??Ｆｉｇ．?１－１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＨＡ?ｇｅｎｅｓ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ－ＨＡ；?２：?Ｆ９８－ＨＡ；??ｌＯＯＯｂｐ－丨?＇￣１４９７ｂｐ??圖１－２?ＮＰ片段的ＰＣＲ擴(kuò)增圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?ｈ?ｒＴＸ?毒株的?ＮＰ?片段；??Ｆｉｇ．?１－２?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＮＰ?ｇｅｎｅ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ－ＮＰ；??３．１．２酶切鑒定??將ＨＡ基因和ＮＰ基因真核重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用１?％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，??結(jié)果顯示：ＰＣＡＧＧＳ－ｒＴＸ－ＨＡ和ＰＣＡＧＧＳ－Ｆ９８－ＨＡ重組質(zhì)粒酶切圖中出現(xiàn)兩條大小分??別為１７００?ｂｐ左右和４７００?ｂｐ左右的條帶（圖１－３）：?ＰＣＡＧＧＳ－ｒＴＸ－ＮＰ重組質(zhì)粒酶切圖??中出現(xiàn)兩條大小分別為１５００?ｂｐ左右和４７００?ｂｐ左右的條帶（圖１－４），所得結(jié)果與預(yù)期??一致。比對(duì)測序驗(yàn)證結(jié)果得出插入的目的基因序列也和原始序列
?第一章Ｈ９Ｎ２亞型禽流感病毒ＨＡ和ＮＰ基因克隆及表達(dá)???以毒株ｒＴＸ和Ｆ９８的ｃＤＮＡ為模版，用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)増，ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１?％??瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)果如圖１－１和圖１－２所示，擴(kuò)增出大約１７００?ｂｐ左右的??ＨＡ片段和１５００?ｂｐ左右ＮＰ片段，結(jié)果與預(yù)期相符。??Ｍ?１?２??２０００ｂｐ?—??ｉ?ＯＯＯｂｐ?——??圖１－１?ＨＡ片段的ＰＣＲ擴(kuò)增圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ?毒株的?ＨＡ?片段；２：?Ｆ９８?毒株的?ＨＡ?片段；??Ｆｉｇ．?１－１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＨＡ?ｇｅｎｅｓ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ－ＨＡ；?２：?Ｆ９８－ＨＡ；??ｌＯＯＯｂｐ－丨?＇￣１４９７ｂｐ??圖１－２?ＮＰ片段的ＰＣＲ擴(kuò)增圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?ｈ?ｒＴＸ?毒株的?ＮＰ?片段；??Ｆｉｇ．?１－２?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＮＰ?ｇｅｎｅ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ－ＮＰ；??３．１．２酶切鑒定??將ＨＡ基因和ＮＰ基因真核重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用１?％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，??結(jié)果顯示：ＰＣＡＧＧＳ－ｒＴＸ－ＨＡ和ＰＣＡＧＧＳ－Ｆ９８－ＨＡ重組質(zhì)粒酶切圖中出現(xiàn)兩條大小分??別為１７００?ｂｐ左右和４７００?ｂｐ左右的條帶（圖１－３）：?ＰＣＡＧＧＳ－ｒＴＸ－ＮＰ重組質(zhì)粒酶切圖??中出現(xiàn)兩條大小分別為１５００?ｂｐ左右和４７００?ｂｐ左右的條帶（圖１－４），所得結(jié)果與預(yù)期??一致。比對(duì)測序驗(yàn)證結(jié)果得出插入的目的基因序列也和原始序列
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2017—2018年華東地區(qū)H9亞型禽流感病毒分離毒株的抗原差異分析[J]. 申松瑋,王澤源,范威峰,祝常椿,陸游,石寶蘭,劉雷,沈海峰,焦庫華,秦濤,陳素娟,彭大新,劉秀梵. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(06)
[2]禽流感病毒NP蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 肖倩,姚露,畢振威,雷靜,顏焰,閆麗萍. 畜牧與獸醫(yī). 2018(12)
[3]DNA免疫技術(shù)在單克隆抗體開發(fā)中的研究進(jìn)展[J]. 葉爾那扎爾·努爾吐熱,邱麗芬,張富春,張茂祥. 生物技術(shù)通報(bào). 2019(02)
[4]H6N6亞型禽流感病毒N6基因的原核表達(dá)與多克隆抗體制備[J]. 萬潤,華敏,龍立書,賀欣薇,羅引幸,周碧君,王開功,程振濤,文明. 中國畜牧獸醫(yī). 2018(11)
[5]2016—2017年華東地區(qū)活禽市場7株H9N2禽流感病毒遺傳進(jìn)化分析[J]. 蔣大秀,馬靜,王曉泉,胡順林,劉曉文,劉秀梵. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(08)
[6]H9N2亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性分析[J]. 李佳昕,孫文強(qiáng),袁水慶,王曉泉,劉曉文,劉秀梵. 中國家禽. 2017(21)
[7]華東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒HA基因的遺傳演化分析[J]. 黃欣梅,李銀,劉宇卓,趙冬敏,楊婧,韓凱凱. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2015(02)
[8]禽流感診斷檢測方法綜述[J]. 王涌. 山東畜牧獸醫(yī). 2014(05)
[9]真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-MyoD-HA-His的構(gòu)建及功能檢測[J]. 杜朝,玉蕾葉,孫國杰,王英澤. 河北科技大學(xué)學(xué)報(bào). 2014(02)
[10]DNA疫苗的研究進(jìn)展[J]. 楊海,王芳宇. 中國畜牧獸醫(yī). 2013(01)
博士論文
[1]H7N9亞型禽流感病毒檢測方法的建立及標(biāo)記疫苗的研制[D]. 孫志豪.揚(yáng)州大學(xué) 2018
[2]H9N2亞型流感病毒HA基因變異分析及對(duì)雞免疫機(jī)能的影響[D]. 馮強(qiáng).山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[3]禽流感病毒M2重組多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究[D]. 張國廣.廈門大學(xué) 2007
[4]中國大陸H9N2亞型禽流感病毒遺傳演化關(guān)系的研究[D]. 李曦.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2002
碩士論文
[1]2017-2018中國H5亞型禽流感病毒的生物學(xué)特性研究[D]. 韓舒雨.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2019
[2]H9N2亞型禽流感病毒抗原變異的研究[D]. 屈孟錦.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2019
[3]抗H7亞型流感病毒單克隆抗體的制備與應(yīng)用[D]. 陳玲玲.南昌大學(xué) 2019
[4]2016-2018年華東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒分子流行病學(xué)及致病性研究[D]. 蔣大秀.揚(yáng)州大學(xué) 2019
[5]基于NP單克隆抗體的檢測禽流感病毒ELISA方法的建立[D]. 劉敏.揚(yáng)州大學(xué) 2018
[6]2014～2016年華東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒遺傳進(jìn)化分析及氣溶膠傳播特性研究[D]. 孫文琪.揚(yáng)州大學(xué) 2017
[7]抗H9N2亞型禽流感病毒X-19流行株單克隆抗體的制備及鑒定[D]. 張劍.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[8]2013-2015年華東地區(qū)H9N2禽流感病毒的流行病學(xué)調(diào)查及單克隆抗體的研制[D]. 鞠勇.揚(yáng)州大學(xué) 2016
[9]H9N2亞型禽流感病毒抗原變異株單抗的制備及其在抗原變異機(jī)制研究中的應(yīng)用[D]. 顧家英.揚(yáng)州大學(xué) 2016
[10]雞傳染性喉氣管炎病毒單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[D]. 張林.揚(yáng)州大學(xué) 2016
本文編號(hào)：3067598
【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省
【文章頁數(shù)】：80 頁
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
圖１流感病毒粒子的形態(tài)結(jié)構(gòu)（引自張劍２０１６）??Ｆｉｇ?１?．Ｐａｒｔｉｃｌｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｉｎｆｌｕｅｎｚａ?ｖｉｒｕｓ??
?第一章Ｈ９Ｎ２亞型禽流感病毒ＨＡ和ＮＰ基因克隆及表達(dá)???以毒株ｒＴＸ和Ｆ９８的ｃＤＮＡ為模版，用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)増，ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１?％??瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)果如圖１－１和圖１－２所示，擴(kuò)增出大約１７００?ｂｐ左右的??ＨＡ片段和１５００?ｂｐ左右ＮＰ片段，結(jié)果與預(yù)期相符。??Ｍ?１?２??２０００ｂｐ?—??ｉ?ＯＯＯｂｐ?——??圖１－１?ＨＡ片段的ＰＣＲ擴(kuò)增圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ?毒株的?ＨＡ?片段；２：?Ｆ９８?毒株的?ＨＡ?片段；??Ｆｉｇ．?１－１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＨＡ?ｇｅｎｅｓ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ－ＨＡ；?２：?Ｆ９８－ＨＡ；??ｌＯＯＯｂｐ－丨?＇￣１４９７ｂｐ??圖１－２?ＮＰ片段的ＰＣＲ擴(kuò)增圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?ｈ?ｒＴＸ?毒株的?ＮＰ?片段；??Ｆｉｇ．?１－２?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＮＰ?ｇｅｎｅ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ－ＮＰ；??３．１．２酶切鑒定??將ＨＡ基因和ＮＰ基因真核重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用１?％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，??結(jié)果顯示：ＰＣＡＧＧＳ－ｒＴＸ－ＨＡ和ＰＣＡＧＧＳ－Ｆ９８－ＨＡ重組質(zhì)粒酶切圖中出現(xiàn)兩條大小分??別為１７００?ｂｐ左右和４７００?ｂｐ左右的條帶（圖１－３）：?ＰＣＡＧＧＳ－ｒＴＸ－ＮＰ重組質(zhì)粒酶切圖??中出現(xiàn)兩條大小分別為１５００?ｂｐ左右和４７００?ｂｐ左右的條帶（圖１－４），所得結(jié)果與預(yù)期??一致。比對(duì)測序驗(yàn)證結(jié)果得出插入的目的基因序列也和原始序列
?第一章Ｈ９Ｎ２亞型禽流感病毒ＨＡ和ＮＰ基因克隆及表達(dá)???以毒株ｒＴＸ和Ｆ９８的ｃＤＮＡ為模版，用對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)増，ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)１?％??瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)果如圖１－１和圖１－２所示，擴(kuò)增出大約１７００?ｂｐ左右的??ＨＡ片段和１５００?ｂｐ左右ＮＰ片段，結(jié)果與預(yù)期相符。??Ｍ?１?２??２０００ｂｐ?—??ｉ?ＯＯＯｂｐ?——??圖１－１?ＨＡ片段的ＰＣＲ擴(kuò)增圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ?毒株的?ＨＡ?片段；２：?Ｆ９８?毒株的?ＨＡ?片段；??Ｆｉｇ．?１－１?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＨＡ?ｇｅｎｅｓ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ－ＨＡ；?２：?Ｆ９８－ＨＡ；??ｌＯＯＯｂｐ－丨?＇￣１４９７ｂｐ??圖１－２?ＮＰ片段的ＰＣＲ擴(kuò)增圖??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?ｈ?ｒＴＸ?毒株的?ＮＰ?片段；??Ｆｉｇ．?１－２?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＮＰ?ｇｅｎｅ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ｒＴＸ－ＮＰ；??３．１．２酶切鑒定??將ＨＡ基因和ＮＰ基因真核重組質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物用１?％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，??結(jié)果顯示：ＰＣＡＧＧＳ－ｒＴＸ－ＨＡ和ＰＣＡＧＧＳ－Ｆ９８－ＨＡ重組質(zhì)粒酶切圖中出現(xiàn)兩條大小分??別為１７００?ｂｐ左右和４７００?ｂｐ左右的條帶（圖１－３）：?ＰＣＡＧＧＳ－ｒＴＸ－ＮＰ重組質(zhì)粒酶切圖??中出現(xiàn)兩條大小分別為１５００?ｂｐ左右和４７００?ｂｐ左右的條帶（圖１－４），所得結(jié)果與預(yù)期??一致。比對(duì)測序驗(yàn)證結(jié)果得出插入的目的基因序列也和原始序列
【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2017—2018年華東地區(qū)H9亞型禽流感病毒分離毒株的抗原差異分析[J]. 申松瑋,王澤源,范威峰,祝常椿,陸游,石寶蘭,劉雷,沈海峰,焦庫華,秦濤,陳素娟,彭大新,劉秀梵. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(06)
[2]禽流感病毒NP蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 肖倩,姚露,畢振威,雷靜,顏焰,閆麗萍. 畜牧與獸醫(yī). 2018(12)
[3]DNA免疫技術(shù)在單克隆抗體開發(fā)中的研究進(jìn)展[J]. 葉爾那扎爾·努爾吐熱,邱麗芬,張富春,張茂祥. 生物技術(shù)通報(bào). 2019(02)
[4]H6N6亞型禽流感病毒N6基因的原核表達(dá)與多克隆抗體制備[J]. 萬潤,華敏,龍立書,賀欣薇,羅引幸,周碧君,王開功,程振濤,文明. 中國畜牧獸醫(yī). 2018(11)
[5]2016—2017年華東地區(qū)活禽市場7株H9N2禽流感病毒遺傳進(jìn)化分析[J]. 蔣大秀,馬靜,王曉泉,胡順林,劉曉文,劉秀梵. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(08)
[6]H9N2亞型禽流感病毒血凝素單克隆抗體的制備及生物學(xué)特性分析[J]. 李佳昕,孫文強(qiáng),袁水慶,王曉泉,劉曉文,劉秀梵. 中國家禽. 2017(21)
[7]華東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒HA基因的遺傳演化分析[J]. 黃欣梅,李銀,劉宇卓,趙冬敏,楊婧,韓凱凱. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2015(02)
[8]禽流感診斷檢測方法綜述[J]. 王涌. 山東畜牧獸醫(yī). 2014(05)
[9]真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）-MyoD-HA-His的構(gòu)建及功能檢測[J]. 杜朝,玉蕾葉,孫國杰,王英澤. 河北科技大學(xué)學(xué)報(bào). 2014(02)
[10]DNA疫苗的研究進(jìn)展[J]. 楊海,王芳宇. 中國畜牧獸醫(yī). 2013(01)
博士論文
[1]H7N9亞型禽流感病毒檢測方法的建立及標(biāo)記疫苗的研制[D]. 孫志豪.揚(yáng)州大學(xué) 2018
[2]H9N2亞型流感病毒HA基因變異分析及對(duì)雞免疫機(jī)能的影響[D]. 馮強(qiáng).山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[3]禽流感病毒M2重組多肽疫苗和DNA疫苗及其粘膜免疫研究[D]. 張國廣.廈門大學(xué) 2007
[4]中國大陸H9N2亞型禽流感病毒遺傳演化關(guān)系的研究[D]. 李曦.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2002
碩士論文
[1]2017-2018中國H5亞型禽流感病毒的生物學(xué)特性研究[D]. 韓舒雨.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2019
[2]H9N2亞型禽流感病毒抗原變異的研究[D]. 屈孟錦.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2019
[3]抗H7亞型流感病毒單克隆抗體的制備與應(yīng)用[D]. 陳玲玲.南昌大學(xué) 2019
[4]2016-2018年華東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒分子流行病學(xué)及致病性研究[D]. 蔣大秀.揚(yáng)州大學(xué) 2019
[5]基于NP單克隆抗體的檢測禽流感病毒ELISA方法的建立[D]. 劉敏.揚(yáng)州大學(xué) 2018
[6]2014～2016年華東地區(qū)H9N2亞型禽流感病毒遺傳進(jìn)化分析及氣溶膠傳播特性研究[D]. 孫文琪.揚(yáng)州大學(xué) 2017
[7]抗H9N2亞型禽流感病毒X-19流行株單克隆抗體的制備及鑒定[D]. 張劍.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[8]2013-2015年華東地區(qū)H9N2禽流感病毒的流行病學(xué)調(diào)查及單克隆抗體的研制[D]. 鞠勇.揚(yáng)州大學(xué) 2016
[9]H9N2亞型禽流感病毒抗原變異株單抗的制備及其在抗原變異機(jī)制研究中的應(yīng)用[D]. 顧家英.揚(yáng)州大學(xué) 2016
[10]雞傳染性喉氣管炎病毒單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[D]. 張林.揚(yáng)州大學(xué) 2016
本文編號(hào)：3067598
本文鏈接：http://sikaile.net/yixuelunwen/dongwuyixue/3067598.html
最近更新
教材專著
