弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生繁殖的機(jī)會(huì)性致病病原體,可以感染包括人在內(nèi)的幾乎所有的溫血?jiǎng)游?嚴(yán)重威脅人類及動(dòng)物健康。正常人感染弓形蟲后,大多數(shù)不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀,呈隱性感染狀態(tài),但對(duì)嬰兒或機(jī)體免疫力低下或免疫抑制時(shí)（AIDS、骨髓移植、器官移植等）可表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床癥狀,甚至可以引起死亡。妊娠期母畜感染該病,�？梢鹆鳟a(chǎn),死產(chǎn),木乃伊胎以及其它一些嚴(yán)重的臨床癥狀,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前,對(duì)于弓形蟲病的防治仍以預(yù)防為主,無特效藥物。因此,研發(fā)切實(shí)有效的疫苗是防治的關(guān)鍵。IMP1蛋白是2011年剛發(fā)現(xiàn)的蛋白,被認(rèn)為在弓形蟲病疫苗開發(fā)方面具有重要潛力。本研究通過分子生物學(xué)、基因工程學(xué)、免疫生物學(xué)等方法對(duì)弓形蟲IMP1的表達(dá)特性及免疫原性進(jìn)行研究,探討IMP1及其相關(guān)蛋白的功能,為弓形蟲病防控提供新的思路與方法。1.浙江省動(dòng)物弓形蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查為了解浙江省動(dòng)物弓形蟲病的流行現(xiàn)狀,更好地為弓形蟲病的防治提供科學(xué)的依據(jù),本項(xiàng)目組成員采集了來自浙江省十一地市的813份豬血清、70份奶牛血清、151份山羊血清、213份犬血清及60份貓血清樣品,進(jìn)行了弓形蟲病的血清流行病學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明,豬的... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 弓形蟲與弓形蟲病
        1 弓形蟲病原形態(tài)
        2 弓形蟲生活史
        3 弓形蟲的抵抗力
        4 弓形蟲流行病學(xué)
            4.1 檢測(cè)方法
            4.2 流行情況
        5 弓形蟲病的防治
        6 小結(jié)
    第二章 弓形蟲毒力因子研究進(jìn)展
        1 基因型與毒力
        2 弓形蟲滑行運(yùn)動(dòng)和粘附,入侵及逸出宿主細(xì)胞過程相關(guān)毒力因子
            2.1 穩(wěn)定的表膜蛋白和脂肪
            2.2 棒狀體頸部蛋白：RONs
            2.3 棒狀體球部蛋白
            2.4 瞬時(shí)表膜蛋白：MICs
            2.5 弓形蟲與宿主細(xì)胞互作相關(guān)毒力因子
            2.6 其它因子
        3 參與蟲體發(fā)育及轉(zhuǎn)化的毒力因子
            3.1 致密顆粒
            3.2 細(xì)胞骨架
        4 包囊形成和蟲荷
        5 小結(jié)
    第三章 弓形蟲疫苗研究進(jìn)展
        1 弓形蟲疫苗防治機(jī)制
        2 弓形蟲疫苗研究現(xiàn)狀
            2.1 弓形蟲蟲體抗原
            2.2 亞單位疫苗
            2.3 核酸疫苗
        3 小結(jié)
第二部分 研究內(nèi)容
    第四章 浙江省動(dòng)物弓形蟲病血清流行病學(xué)調(diào)查
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 主要材料試劑與儀器
            1.2 樣品的采集
            1.3 樣品的檢測(cè)
            1.4 數(shù)據(jù)分析
        2 結(jié)果
            2.1 浙江省豬、奶牛、山羊、犬、貓弓形蟲血清陽性率
            2.2 浙江省豬弓形蟲流行病學(xué)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子分析
            2.3 浙江省犬弓形蟲流行病學(xué)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子分析
            2.4 浙江省貓弓形蟲流行病學(xué)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因子分析
        3 討論
    第五章 基于SAG1基因弓形蟲熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 參考蟲株、模板和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.2 主要試劑與儀器
                1.1.3 溶液配制
            1.2 方法
                1.2.1 弓形蟲基因組DNA的制備
                1.2.2 引物設(shè)計(jì)
                1.2.3 普通PCR
                1.2.4 定量PCR擴(kuò)增
                1.2.5 熒光定量PCR特異性試驗(yàn)
                1.2.6 熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)
                1.2.7 熒光定量PCR穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)
                1.2.8 臨床樣品的檢測(cè)
        2 結(jié)果
            2.1 陽性質(zhì)粒pMD-SAG1的構(gòu)建
            2.2 熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定
            2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
            2.4 熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果
            2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果
            2.6 熒光定量PCR的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果
            2.7 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果
        3 討論
    第六章 弓形蟲IMP1的表達(dá)特性研究
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 參考蟲株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.2 菌株與質(zhì)粒
                1.1.3 工具酶與試劑
                1.1.4 主要儀器設(shè)備
                1.1.5 溶液配制
            1.2 方法
                1.2.1 引物設(shè)計(jì)
                1.2.2 弓形蟲速殖子總RNA的提取
                1.2.3 cDNA第一鏈的合成
                1.2.4 弓形蟲IMP1基因的RT-PCR擴(kuò)增
                1.2.5 弓形蟲IMP1基因的克隆
                1.2.6 測(cè)序分析
                1.2.7 弓形蟲IMP1原核表達(dá)載體的構(gòu)建
                1.2.8 弓形蟲IMP1的原核表達(dá)
                1.2.9 SDS-PAGE
                1.2.10 Western blot鑒定
                1.2.11 目的蛋白的純化與復(fù)性
                1.2.12 多克隆抗體的制備
                1.2.13 間接ELISA法檢測(cè)抗體水平
                1.2.14 Vero細(xì)胞及弓形蟲的傳代、培養(yǎng)
                1.2.15 游離速殖子IMP1的亞細(xì)胞定位
                1.2.16 入侵過程中速殖子IMP1的亞細(xì)胞定位
                1.2.17 入侵后納蟲空泡中速殖子IMP1的亞細(xì)胞定位
        2 結(jié)果
            2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
            2.2 弓形蟲pET30a-IMP1質(zhì)粒的PCR鑒定及酶切分析
            2.3 測(cè)序結(jié)果分析
            2.4 pET30a-IMP1的原核表達(dá)及Western-blot鑒定
            2.5 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定
            2.6 不同時(shí)期弓形蟲IMP1蛋白的亞細(xì)胞定位
        3 討論
    第七章 弓形蟲二價(jià)重組亞單位疫苗rSAG1/IMP1的免疫原性研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 弓形蟲與試驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.2 菌株與質(zhì)粒
                1.1.3 工具酶與試劑
                1.1.4 主要儀器設(shè)備
                1.1.5 溶液配制
            1.2 試驗(yàn)方法
                1.2.1 弓形蟲基因組DNA的制備
                1.2.2 弓形蟲IMP1、SAG1基因的擴(kuò)增
                1.2.3 弓形蟲IMP1及SAG1基因的克隆
                1.2.4 測(cè)序分析
                1.2.5 弓形蟲SAG1-IMP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建
                1.2.6 IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)目的蛋白
                1.2.7 SDS-PAGE
                1.2.8 Western-blotting
                1.2.9 目的蛋白的純化
                1.2.10 重組亞單位疫苗的免疫效果研究
        2 結(jié)果
            2.1 重組質(zhì)粒pET30a-SAG1-IMP1的PCR鑒定
            2.2 重組質(zhì)粒pET30a-SAG1-IMP1的測(cè)序結(jié)果
            2.3 rSAG1、rIMP1、rSAG-IMP1的表達(dá)純化
            2.4 重組亞單位疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答
            2.5 抗體亞類的檢測(cè)
            2.6 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
            2.7 胞因子的檢測(cè)
            2.8 動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)
        3 討論
    第八章 減毒沙門氏菌為載體傳遞弓形蟲IMP1基因的免疫原性研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 弓形蟲與試驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.2 菌株與質(zhì)粒
                1.1.3 工具酶與試劑
                1.1.4 主要儀器設(shè)備
                1.1.5 溶液配制
            1.2 試驗(yàn)方法
                1.2.1 弓形蟲基因組DNA的制備
                1.2.2 弓形蟲IMP1、SAG1基因的擴(kuò)增
                1.2.3 弓形蟲IMP1及SAG1基因的克隆
                1.2.4 測(cè)序分析
                1.2.5 弓形蟲IMP1及SAG1-IMP1真核表達(dá)載體的構(gòu)建
                1.2.6 電轉(zhuǎn)用減毒沙門氏菌感受態(tài)的制備
                1.2.7 真核表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入沙門氏菌
                1.2.8 重組沙門氏菌中質(zhì)粒的鑒定
                1.2.9 減毒沙門氏菌活載體核酸疫苗的免疫效果研究
        2 結(jié)果
            2.1 重組質(zhì)粒pMD18-SAG1、pMD18-IMP1、pMD18-IMP1（融合）的PCR鑒定
            2.2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IMP1、pcDNA3.1-IMP1（融合）的PCR鑒定
            2.3 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SAG1-IMP1的PCR鑒定
            2.4 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果
            2.5 活載體核酸疫苗誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答
            2.6 抗體亞類的檢測(cè)
            2.7 疫苗免疫對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響
            2.8 細(xì)胞因子的檢測(cè)
            2.9 動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)
        3 討論
全文結(jié)論
論文創(chuàng)新性
研究展望
附錄1 溶液配制
附錄2 英文縮寫注釋
攻讀博士學(xué)位期間的主要成果
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]浙江地區(qū)犬 貓 豬弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 黃利權(quán),李慧,何士根,毛紅瑞.  中國獸醫(yī)雜志. 2011(06)
[2]遼寧省蓋州市絨山羊弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查[J]. 任忠奎,王敏,趙虹霓,郭琦,劉巖松.  中國動(dòng)物檢疫. 2010(02)
[3]新疆豬、牛、羊弓形蟲病的血清學(xué)調(diào)查[J]. 米曉云,巴音查汗,李文超.  中國獸醫(yī)寄生蟲病. 2007(02)
[4]弗氏佐劑與氫氧化鋁佐劑對(duì)誘導(dǎo)小鼠獲得性免疫應(yīng)答作用的比較[J]. 潘萌,蔣浩琴,周蕓,鄭捷.  現(xiàn)代免疫學(xué). 2006(02)
[5]上海市松江區(qū)家畜弓形蟲病的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 曹向英,朱駿,沈林輝,彭笑蓉,張慧英,孫文梅.  上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2006(01)
[6]規(guī)模豬場(chǎng)弓形蟲病調(diào)查[J]. 朱織云,占松華,余有富,周元寶.  中國動(dòng)物檢疫. 2000(09)



本文編號(hào)：3065241