弓形蟲是一種專性細胞內寄生繁殖的機會性致病病原體,可以感染包括人在內的幾乎所有的溫血動物,嚴重威脅人類及動物健康。正常人感染弓形蟲后,大多數不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀,呈隱性感染狀態(tài),但對嬰兒或機體免疫力低下或免疫抑制時（AIDS、骨髓移植、器官移植等）可表現(xiàn)出嚴重的臨床癥狀,甚至可以引起死亡。妊娠期母畜感染該病,�？梢鹆鳟a,死產,木乃伊胎以及其它一些嚴重的臨床癥狀,造成嚴重的經濟損失。目前,對于弓形蟲病的防治仍以預防為主,無特效藥物。因此,研發(fā)切實有效的疫苗是防治的關鍵。IMP1蛋白是2011年剛發(fā)現(xiàn)的蛋白,被認為在弓形蟲病疫苗開發(fā)方面具有重要潛力。本研究通過分子生物學、基因工程學、免疫生物學等方法對弓形蟲IMP1的表達特性及免疫原性進行研究,探討IMP1及其相關蛋白的功能,為弓形蟲病防控提供新的思路與方法。1.浙江省動物弓形蟲病血清流行病學調查為了解浙江省動物弓形蟲病的流行現(xiàn)狀,更好地為弓形蟲病的防治提供科學的依據,本項目組成員采集了來自浙江省十一地市的813份豬血清、70份奶牛血清、151份山羊血清、213份犬血清及60份貓血清樣品,進行了弓形蟲病的血清流行病學調查。結果表明,豬的... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數】：136 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 文獻綜述
    第一章 弓形蟲與弓形蟲病
        1 弓形蟲病原形態(tài)
        2 弓形蟲生活史
        3 弓形蟲的抵抗力
        4 弓形蟲流行病學
            4.1 檢測方法
            4.2 流行情況
        5 弓形蟲病的防治
        6 小結
    第二章 弓形蟲毒力因子研究進展
        1 基因型與毒力
        2 弓形蟲滑行運動和粘附,入侵及逸出宿主細胞過程相關毒力因子
            2.1 穩(wěn)定的表膜蛋白和脂肪
            2.2 棒狀體頸部蛋白：RONs
            2.3 棒狀體球部蛋白
            2.4 瞬時表膜蛋白：MICs
            2.5 弓形蟲與宿主細胞互作相關毒力因子
            2.6 其它因子
        3 參與蟲體發(fā)育及轉化的毒力因子
            3.1 致密顆粒
            3.2 細胞骨架
        4 包囊形成和蟲荷
        5 小結
    第三章 弓形蟲疫苗研究進展
        1 弓形蟲疫苗防治機制
        2 弓形蟲疫苗研究現(xiàn)狀
            2.1 弓形蟲蟲體抗原
            2.2 亞單位疫苗
            2.3 核酸疫苗
        3 小結
第二部分 研究內容
    第四章 浙江省動物弓形蟲病血清流行病學調查
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 主要材料試劑與儀器
            1.2 樣品的采集
            1.3 樣品的檢測
            1.4 數據分析
        2 結果
            2.1 浙江省豬、奶牛、山羊、犬、貓弓形蟲血清陽性率
            2.2 浙江省豬弓形蟲流行病學相關風險因子分析
            2.3 浙江省犬弓形蟲流行病學相關風險因子分析
            2.4 浙江省貓弓形蟲流行病學相關風險因子分析
        3 討論
    第五章 基于SAG1基因弓形蟲熒光定量PCR檢測方法的建立
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 參考蟲株、模板和實驗動物
                1.1.2 主要試劑與儀器
                1.1.3 溶液配制
            1.2 方法
                1.2.1 弓形蟲基因組DNA的制備
                1.2.2 引物設計
                1.2.3 普通PCR
                1.2.4 定量PCR擴增
                1.2.5 熒光定量PCR特異性試驗
                1.2.6 熒光定量PCR敏感性試驗
                1.2.7 熒光定量PCR穩(wěn)定性及重復性試驗
                1.2.8 臨床樣品的檢測
        2 結果
            2.1 陽性質粒pMD-SAG1的構建
            2.2 熒光定量PCR擴增產物的鑒定
            2.3 熒光定量PCR標準曲線的建立
            2.4 熒光定量PCR特異性試驗結果
            2.5 敏感性試驗結果
            2.6 熒光定量PCR的重復性試驗結果
            2.7 臨床樣品檢測結果
        3 討論
    第六章 弓形蟲IMP1的表達特性研究
        摘要
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 參考蟲株和實驗動物
                1.1.2 菌株與質粒
                1.1.3 工具酶與試劑
                1.1.4 主要儀器設備
                1.1.5 溶液配制
            1.2 方法
                1.2.1 引物設計
                1.2.2 弓形蟲速殖子總RNA的提取
                1.2.3 cDNA第一鏈的合成
                1.2.4 弓形蟲IMP1基因的RT-PCR擴增
                1.2.5 弓形蟲IMP1基因的克隆
                1.2.6 測序分析
                1.2.7 弓形蟲IMP1原核表達載體的構建
                1.2.8 弓形蟲IMP1的原核表達
                1.2.9 SDS-PAGE
                1.2.10 Western blot鑒定
                1.2.11 目的蛋白的純化與復性
                1.2.12 多克隆抗體的制備
                1.2.13 間接ELISA法檢測抗體水平
                1.2.14 Vero細胞及弓形蟲的傳代、培養(yǎng)
                1.2.15 游離速殖子IMP1的亞細胞定位
                1.2.16 入侵過程中速殖子IMP1的亞細胞定位
                1.2.17 入侵后納蟲空泡中速殖子IMP1的亞細胞定位
        2 結果
            2.1 PCR擴增結果
            2.2 弓形蟲pET30a-IMP1質粒的PCR鑒定及酶切分析
            2.3 測序結果分析
            2.4 pET30a-IMP1的原核表達及Western-blot鑒定
            2.5 多克隆抗體效價的測定
            2.6 不同時期弓形蟲IMP1蛋白的亞細胞定位
        3 討論
    第七章 弓形蟲二價重組亞單位疫苗rSAG1/IMP1的免疫原性研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 弓形蟲與試驗動物
                1.1.2 菌株與質粒
                1.1.3 工具酶與試劑
                1.1.4 主要儀器設備
                1.1.5 溶液配制
            1.2 試驗方法
                1.2.1 弓形蟲基因組DNA的制備
                1.2.2 弓形蟲IMP1、SAG1基因的擴增
                1.2.3 弓形蟲IMP1及SAG1基因的克隆
                1.2.4 測序分析
                1.2.5 弓形蟲SAG1-IMP1真核表達載體的構建
                1.2.6 IPTG誘導大腸桿菌表達目的蛋白
                1.2.7 SDS-PAGE
                1.2.8 Western-blotting
                1.2.9 目的蛋白的純化
                1.2.10 重組亞單位疫苗的免疫效果研究
        2 結果
            2.1 重組質粒pET30a-SAG1-IMP1的PCR鑒定
            2.2 重組質粒pET30a-SAG1-IMP1的測序結果
            2.3 rSAG1、rIMP1、rSAG-IMP1的表達純化
            2.4 重組亞單位疫苗誘導的體液免疫應答
            2.5 抗體亞類的檢測
            2.6 淋巴細胞轉化試驗
            2.7 胞因子的檢測
            2.8 動物保護性試驗
        3 討論
    第八章 減毒沙門氏菌為載體傳遞弓形蟲IMP1基因的免疫原性研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 弓形蟲與試驗動物
                1.1.2 菌株與質粒
                1.1.3 工具酶與試劑
                1.1.4 主要儀器設備
                1.1.5 溶液配制
            1.2 試驗方法
                1.2.1 弓形蟲基因組DNA的制備
                1.2.2 弓形蟲IMP1、SAG1基因的擴增
                1.2.3 弓形蟲IMP1及SAG1基因的克隆
                1.2.4 測序分析
                1.2.5 弓形蟲IMP1及SAG1-IMP1真核表達載體的構建
                1.2.6 電轉用減毒沙門氏菌感受態(tài)的制備
                1.2.7 真核表達質粒電轉化入沙門氏菌
                1.2.8 重組沙門氏菌中質粒的鑒定
                1.2.9 減毒沙門氏菌活載體核酸疫苗的免疫效果研究
        2 結果
            2.1 重組質粒pMD18-SAG1、pMD18-IMP1、pMD18-IMP1（融合）的PCR鑒定
            2.2 重組質粒pcDNA3.1-IMP1、pcDNA3.1-IMP1（融合）的PCR鑒定
            2.3 重組質粒pcDNA3.1-SAG1-IMP1的PCR鑒定
            2.4 重組質粒的測序結果
            2.5 活載體核酸疫苗誘導體液免疫應答
            2.6 抗體亞類的檢測
            2.7 疫苗免疫對淋巴細胞增殖的影響
            2.8 細胞因子的檢測
            2.9 動物保護性試驗
        3 討論
全文結論
論文創(chuàng)新性
研究展望
附錄1 溶液配制
附錄2 英文縮寫注釋
攻讀博士學位期間的主要成果
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]遼寧省蓋州市絨山羊弓形蟲病的血清學調查[J]. 任忠奎,王敏,趙虹霓,郭琦,劉巖松.  中國動物檢疫. 2010(02)
[3]新疆豬、牛、羊弓形蟲病的血清學調查[J]. 米曉云,巴音查汗,李文超.  中國獸醫(yī)寄生蟲病. 2007(02)
[4]弗氏佐劑與氫氧化鋁佐劑對誘導小鼠獲得性免疫應答作用的比較[J]. 潘萌,蔣浩琴,周蕓,鄭捷.  現(xiàn)代免疫學. 2006(02)
[5]上海市松江區(qū)家畜弓形蟲病的流行病學調查[J]. 曹向英,朱駿,沈林輝,彭笑蓉,張慧英,孫文梅.  上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2006(01)
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本文編號：3065241