發(fā)布時間：2021-03-03 16:50

　　隨著社會經濟和科學研究的發(fā)展，多基因共表達技術在生物醫(yī)藥和農業(yè)生產中的作用越來越重要。目前，常用的多基因共表達方法有內核糖體進入位點（IRES）元件載體、雙向或雙啟動子共表達、多個質粒共轉染及多病毒載體共感染等。但是這些方法都遇到了多基因共表達不平衡及表達量不足的問題，如IRES下游基因的表達對其在IRES之后的特異定位敏感，有可能造成表達沉默，或下游蛋白的表達水平遠低于同一開放閱讀框中上游蛋白的表達水平。2A肽則能夠改善以上缺陷。2A肽屬于cis-水解酶作用元件（CHYSELs），多基因載體在2A肽調控下各基因可獨立表達。與IRES相比，2A肽序列短（54-90bp）、能夠調節(jié)多基因獨立表達且表達效率高，具有其它多基因共表達技術無可比擬的優(yōu)點。目前，大多數(shù)轉基因動物的制備均以單基因表達為目標，而多基因共表達制備轉基因動物的研究較少。利用2A肽生產多基因修飾動物已在小鼠和豬上報道，但在綿羊上未見報道。慢病毒載體轉基因技術是目前家畜生產中效率最高的轉基因技術，2A肽介導的多基因共表達與慢病毒載體相結合制備轉基因動物，具有轉基因效率高、多基因同時表達的特點。在一個轉基因動物上同時表達多個功... 

【文章來源】：石河子大學新疆維吾爾自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：125 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
中英文對照表
第一章 文獻綜述
    1 2A肽在生物醫(yī)藥和生物技術中的研究進展
        1.1 2A肽的起源
        1.2 常見的2A肽及類2A肽序列
        1.3 2A肽的作用機制
        1.4 2A肽介導的蛋白的亞細胞定位
        1.5 2A肽的作用效率
        1.6 2A肽的應用
        1.7 多基因共表達構建策略
        1.8 慢病毒多基因共表達載體
        1.9 前景
    2 DNA甲基化在動物中的研究進展
        2.1 DNA甲基化的表型特征
        2.2 DNA甲基化作用機制
        2.3 DNA甲基化調控信號
        2.4 DNA甲基化的分析方法
        2.5 DNA甲基化調節(jié)因子
        2.6 DNA甲基化抑制劑
        2.7 DNA甲基化與染色質相關性
        2.8 組蛋白修飾
        2.9 組蛋白去乙�；敢种苿�
        2.10 甲基化在家畜中的研究現(xiàn)狀
第二章 三熒光基因共表達載體pLEX-2A-TYG的構建及其在真核細胞中的表達
    1 實驗材料
        1.1 本實驗使用的載體
        1.2 本實驗使用的細胞株
        1.3 本實驗主要試劑
        1.4 本實驗主要儀器
        1.5 主要試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 2A-linker的構建
        2.2 引物的設計
        2.3 多聚酶鏈式反應（PCR）
        2.4 限制性酶酶切實驗
        2.5 連接反應
        2.6 克隆轉化
        2.7 陽性重組子的篩選鑒定9
        2.8 膠回收實驗9
        2.9 細胞的培養(yǎng)10
        2.10 質粒的提取
        2.11 質粒轉染實驗
        2.12 熒光顯微鏡檢測12
        2.13 Western blotting檢測
    3 結果
        3.1 2A肽-linker片段的獲取
        3.2 質粒pacGFP1-N1的改造
        3.3 質粒ptdtomato-2A和pzsYellow1-2A的獲得
        3.4 質粒ptdTomato-acGFP1和質粒pzsYellow1-acGFP1的獲得
        3.5 質粒p2A-TYG的獲得
        3.6 質粒pLEX-2A-TYG的獲得
        3.7 質粒轉染的熒光檢測
        3.8 Western blotting檢測結果
    4 討論
        4.1 Kozak consensus sequence
        4.2 2A肽介導的多基因載體在細胞中表達
        4.3 酶切位點的保護堿基
        4.4 多基因載體中三熒光蛋白基因的表達檢測結果分析
第三章 慢病毒的包裝及滴毒檢測
    1 實驗材料和方法
        1.1 實驗細胞株
        1.2 實驗所用載體
        1.3 實驗主要試劑
        1.4 主要試劑的配制
        1.5 主要實驗儀器
    2 實驗方法
        2.1 細胞的培養(yǎng)
        2.2 重組質粒的大量提取
        2.3 病毒的包裝
        2.4 慢病毒滴度的測定
        2.5 慢病毒的感染
        2.6 單克隆細胞的篩選
        2.7 激光共聚焦檢測
    3 結果
        3.1 質粒的質量和濃度檢測
        3.2 包裝病毒的滴度檢測
        3.3 單克隆細胞的篩選及檢測
    4 討論
        4.1 慢病毒載體特點
        4.2 慢病毒的包裝
        4.3 病毒的濃縮
        4.4 病毒滴度的測定
        4.5 提高病毒載體體外感染的能力
        4.6 實驗室安全措施
第四章 轉基因羊的生產和檢測
    1 實驗材料
        1.1 實驗動物
        1.2 實驗試劑
        1.3 主要試劑的配制
        1.4 主要儀器
    2 實驗方法
        2.1 轉基因羊的生產
        2.2 轉基因羊尾組織 DNA 的提取
        2.3 轉基因羊的 PCR 檢測
        2.4 Western blotting 檢測
        2.5 基因組 DNA Southern blotting
        2.6 RT-PCR 檢測
        2.7 DNA 甲基化分析
        2.8 CMV 啟動子轉錄因子結合位點分析
        2.9 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 三色熒光蛋白基因共表達慢病毒轉基因羊的生產情況
        3.2 轉基因羊的整合檢測結果
        3.3 轉基因羊甲基化分析
        3.4 CMV啟動子轉錄因子結合位點分析結果 50
    4 討論
        4.1 慢病毒載體在轉基因動物中的應用
        4.2 2A肽在慢病毒介導的生物技術中的應用
        4.3 轉基因羊DNA甲基化分析
        4.4 DNA甲基化檢測方法
        4.5 CMV啟動子轉錄因子結合位點
第五章 轉基因羊內外源基因 DN A 甲基化機制初步研究
    1 材料和方法
        1.1 實驗試劑
        1.2 實驗材料
        1.3 實驗儀器
        1.4 主要試劑的配制
    2 實驗方法
        2.1 成纖維細胞的分離
        2.2 成纖維細胞的純化
        2.3 纖維細胞的培養(yǎng)
        2.4 轉基因成纖維細胞的藥物處理實驗
        2.5 熒光顯微鏡檢測
        2.6 流式細胞術檢測
        2.7 統(tǒng)計分析
    3 結果
        3.1 成纖維細胞的分離和純化
        3.2 TSA和5-azaC對成纖維細胞表觀狀態(tài)的影響
        3.3 流式細胞術檢測結果
    4 討論
        4.1 轉基因表達的影響因素
        4.2 DN A 甲基化轉移酶抑制劑-5-azaC
        4.3 去乙酰化酶抑制劑 - TSA
        4.4 流式細胞術檢測
第六章 小結、創(chuàng)新點、展望
    1 小結
    2 創(chuàng)新點
    3 展望
參考文獻
附錄
作者簡介
致謝
導師評閱表


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Production of Transgenic Korean Native Cattle Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein Using a FIV-Based Lentiviral Vector Injected into MII Oocytes[J]. Yong-Nan Xu,Sang-Jun Uhm,Bon-Chul Koo,Mo-Sun Kwon,Ji-Yeol Roh,Jung-Seok Yang,Hyun-Yong Choi,Young-Tae Heo,Xiang-Shun Cui,Joon-Ho Yoon,Dae-Hwan Ko,Teoan Kim,Nam-Hyung Kim.  遺傳學報. 2013(01)
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[8]牛4種組織中ZAR1基因表達及DNA甲基化修飾[J]. 辛鵬慧,岳永莉,李燕,于海泉.  畜牧與獸醫(yī). 2009(10)
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本文編號：3061595