激活素A通過TGFβ/SMAD信號通路促進雞原始生殖細胞增殖
發(fā)布時間：2021-03-03 07:42
原始生殖細胞（primordial germ cells,PGCs）是一類具有分化潛能的生殖細胞。為了檢測激活素A（activin A）對雞胚血液PGCs體外存活和增殖的影響,本研究從第1315期雞胚血液中分離提取PGCs,并進行鑒定;在完全培養(yǎng)液中分別添加0和100 ng/m L activin A培養(yǎng)48 h后,檢測PGCs數(shù)目、形態(tài)及細胞周期;檢測Dazl（deleted in azoospermia-like）基因甲基化水平;并通過Western blot檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）信號通路中TGF-β、SMAD2/3的表達和磷酸化變化。結(jié)果顯示,從雞胚血液中分離的PGCs,經(jīng)過紅細胞裂解液處理和傳代后,可獲得高純度PGCs,且具有良好的生長趨勢。培養(yǎng)的PGCs呈階段特異性胚胎抗原（stage specific embryonic antigen 1,SSEA-1）、雞（Gallus gallus）VASA同源基因（chicken vasa homologue,CVH）免疫染色和過碘酸希夫（p...
【文章來源】：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報. 2017,25(04)北大核心
【文章頁數(shù)】：10 頁
【部分圖文】：
雞胚血液PGCs的鑒定Figure2IdentificationofchickenembryonicbloodPGCs
觳鈇ctivinA對PGCs增殖的作圖2雞胚血液PGCs的鑒定Figure2IdentificationofchickenembryonicbloodPGCsA.SSEA-1免疫熒光染色，陽性；B.CVH免疫熒光染色，陽性；C.PAS反應(yīng)，陽性；D.PGCs分子標記的qRT-PCR檢測。M：DL500markerA.ImmunofluencestainingofSSEA-1withpositiveresult;B.ImmunofluencestainingofCVHwithpositiveresult;C.PASstain-ingwithpositiveresult.D.qRT-PCRanalysisofPGCs.M:DL500marker20μm20μm20μm20μm20μm20μm→→→→→→ABCDEF圖1雞胚血液PGCs的形態(tài)Figure1MorphologyofchickenembryonicbloodPGCsculturedinvitroA~B.剛分離出來的PGCs；C~D.經(jīng)ACK處理后的PGCs；E~F.培養(yǎng)7d的PGCs。→：PGCs；：成纖維細胞；：血紅細胞A~B.PGCsfreshlyisolatedfromstage13~15embryos;C~D.PGCsafterACKprocession;E~F.CultureofbloodPGCsfor7days.→:PGCs;:Fibroblasts;:Bloodcells542
圖4激活素A對雞胚PGCs細胞周期的影響Figure4EffectofactivinAoncellcycleofPGCsA.對照組；B.100ng/mL激活素A處理組；C.激活素A對細胞周期蛋白基因表達的影響。Cyclin：細胞周期蛋白；CDK：細胞周期蛋白依賴性激酶；內(nèi)參基因：β-actin，n=3；*：差異顯著(P＜0.05)，下同A.Controlgroup;B.100ng/mLactivinAtreatmentgroup;C.TheeffectofactivinAonexpressionofcellcycleregulatinggenes.CDK:Cyclin-dependentkinases;Referefcegene:β-actin,n=3;*:Significantdifference(P＜0.05),thesamebelow圖3激活素A對雞胚血液PGCs細胞增殖的影響Figure3TheeffectofActivinAontheproliferationofchickenembryonicbloodPGCsA.對照組；B.PGCs經(jīng)過100ng/mL激活素A處理48h后的細胞形態(tài)；C.PGCs細胞數(shù)目統(tǒng)計。**：差異極顯著(P＜0.01)A.Controlgroup;B.MorphologyofPGCstreatedwith100ng/mLactivinAfor48h.C.StatisticsanalysisofPGCsnumber.**:Extremelysignificantdifference(P＜0.01)ABC50μ50mμm用，通過qRT-PCR對細胞周期調(diào)控相關(guān)基因CDK2/CyclinD1和CDK6/CyclinE進行了檢測，細胞周期蛋白及蛋白激酶在細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變過程中，起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，其表達水平反映了細胞的增殖狀態(tài)。結(jié)果顯示，100ng/mLactivinA顯著上調(diào)了CDK2/CyclinD1和CDK6/CyclinE的表達水平(P＜0.05)(圖4C)，進一步說明ac-tivinA能加速細胞有絲分裂周期，促進雞胚血液PGCs的增殖。2.5activinA對PGCs中Dazl甲基化的影響通過亞硫酸測序的方法檢測activinA處理對Dazl基因DNA甲基化的影響。電泳結(jié)果顯示，引物特異性很好，可用于進一步實驗(圖5A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dazl基因的甲基化位點變化明顯，對照組處于高甲基化狀態(tài)，而activinA處理后甲基化程度顯著降?
【參考文獻】：
期刊論文
[1]cNanog和cPouV表達下調(diào)對雞胚胎干細胞（cESCs）多能性的影響[J]. 陳志勝,彭特,陳勝鋒,李東升,計慧琴,王丙云,陳金頂. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報. 2014(08)
本文編號：3060891
【文章來源】：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報. 2017,25(04)北大核心
【文章頁數(shù)】：10 頁
【部分圖文】：
雞胚血液PGCs的鑒定Figure2IdentificationofchickenembryonicbloodPGCs
觳鈇ctivinA對PGCs增殖的作圖2雞胚血液PGCs的鑒定Figure2IdentificationofchickenembryonicbloodPGCsA.SSEA-1免疫熒光染色，陽性；B.CVH免疫熒光染色，陽性；C.PAS反應(yīng)，陽性；D.PGCs分子標記的qRT-PCR檢測。M：DL500markerA.ImmunofluencestainingofSSEA-1withpositiveresult;B.ImmunofluencestainingofCVHwithpositiveresult;C.PASstain-ingwithpositiveresult.D.qRT-PCRanalysisofPGCs.M:DL500marker20μm20μm20μm20μm20μm20μm→→→→→→ABCDEF圖1雞胚血液PGCs的形態(tài)Figure1MorphologyofchickenembryonicbloodPGCsculturedinvitroA~B.剛分離出來的PGCs；C~D.經(jīng)ACK處理后的PGCs；E~F.培養(yǎng)7d的PGCs。→：PGCs；：成纖維細胞；：血紅細胞A~B.PGCsfreshlyisolatedfromstage13~15embryos;C~D.PGCsafterACKprocession;E~F.CultureofbloodPGCsfor7days.→:PGCs;:Fibroblasts;:Bloodcells542
圖4激活素A對雞胚PGCs細胞周期的影響Figure4EffectofactivinAoncellcycleofPGCsA.對照組；B.100ng/mL激活素A處理組；C.激活素A對細胞周期蛋白基因表達的影響。Cyclin：細胞周期蛋白；CDK：細胞周期蛋白依賴性激酶；內(nèi)參基因：β-actin，n=3；*：差異顯著(P＜0.05)，下同A.Controlgroup;B.100ng/mLactivinAtreatmentgroup;C.TheeffectofactivinAonexpressionofcellcycleregulatinggenes.CDK:Cyclin-dependentkinases;Referefcegene:β-actin,n=3;*:Significantdifference(P＜0.05),thesamebelow圖3激活素A對雞胚血液PGCs細胞增殖的影響Figure3TheeffectofActivinAontheproliferationofchickenembryonicbloodPGCsA.對照組；B.PGCs經(jīng)過100ng/mL激活素A處理48h后的細胞形態(tài)；C.PGCs細胞數(shù)目統(tǒng)計。**：差異極顯著(P＜0.01)A.Controlgroup;B.MorphologyofPGCstreatedwith100ng/mLactivinAfor48h.C.StatisticsanalysisofPGCsnumber.**:Extremelysignificantdifference(P＜0.01)ABC50μ50mμm用，通過qRT-PCR對細胞周期調(diào)控相關(guān)基因CDK2/CyclinD1和CDK6/CyclinE進行了檢測，細胞周期蛋白及蛋白激酶在細胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變過程中，起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，其表達水平反映了細胞的增殖狀態(tài)。結(jié)果顯示，100ng/mLactivinA顯著上調(diào)了CDK2/CyclinD1和CDK6/CyclinE的表達水平(P＜0.05)(圖4C)，進一步說明ac-tivinA能加速細胞有絲分裂周期，促進雞胚血液PGCs的增殖。2.5activinA對PGCs中Dazl甲基化的影響通過亞硫酸測序的方法檢測activinA處理對Dazl基因DNA甲基化的影響。電泳結(jié)果顯示，引物特異性很好，可用于進一步實驗(圖5A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dazl基因的甲基化位點變化明顯，對照組處于高甲基化狀態(tài)，而activinA處理后甲基化程度顯著降?
【參考文獻】：
期刊論文
[1]cNanog和cPouV表達下調(diào)對雞胚胎干細胞（cESCs）多能性的影響[J]. 陳志勝,彭特,陳勝鋒,李東升,計慧琴,王丙云,陳金頂. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報. 2014(08)
本文編號：3060891
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