犬瘟熱病毒（CDV）感染引起的犬瘟熱（CD）是水貂致死性疾病中的主要傳染病之一,給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。該病沒有有效的治療方法,主要通過疫苗免疫進行預防,但是越來越多的文獻表明,免疫過疫苗的動物仍能夠發(fā)病。如何有效防控CDV感染一直是研究者們關(guān)注的熱點。病毒與宿主之間的相互平衡和制約決定了疾病進程和轉(zhuǎn)歸,因此更好的了解病毒-宿主之間相互作用關(guān)系有助于發(fā)掘潛在的抗病毒靶標。本研究首次利用iTRAQ技術(shù)對CDV感染前后的Mv.1.Lu細胞進行了比較蛋白質(zhì)組學分析,并且對TLR3對CDV感染和復制增殖的影響和作用機制進行了研究,以期為有效防控水貂CDV感染提供一定的理論依據(jù)。為了揭示CDV與水貂細胞內(nèi)蛋白之間的互作關(guān)系,我們利用蛋白質(zhì)組學技術(shù)對CDV PS毒株感染前后24 h的Mv.1.Lu細胞內(nèi)的蛋白表達變化情況進行了分析。共鑒定到520個差異蛋白,包括151個上調(diào)蛋白和369個下調(diào)蛋白。利用DAVID和UniProt數(shù)據(jù)庫進行功能富集分析表明,差異蛋白參與多種生物學過程。Network和KEGG通路分析顯示差異蛋白主要涉及NF-κB信號通路,此外還參與了NLRs和TLRs等通路... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 TLRS介導的天然免疫應答
        1.1.1 TLRs的分布及其結(jié)構(gòu)和相應配體
        1.1.2 TLRs下游接頭蛋白及其信號途徑
        1.1.3 非TLRs的其他PRRs
    1.2 犬瘟熱病毒（CDV）
        1.2.1 CDV基本特性
        1.2.2 臨床特征
        1.2.3 致病性研究
    1.3 CDV與天然免疫應答
        1.3.1 細胞因子與免疫抑制
        1.3.2 細胞因子與脫髓鞘腦白質(zhì)炎（DL）
        1.3.3 IFNs與CDV感染
第二章 CDV感染Mv.1.Lu細胞的蛋白質(zhì)組學分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 細胞與病毒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要軟件
        2.1.5 溶液配制
        2.1.6 病毒預處理
        2.1.7 病毒感染Mv.1.Lu細胞的動力學實驗
        2.1.8 用于蛋白質(zhì)組學分析的樣品制備
        2.1.9 iTRAQ定量
        2.1.10 差異蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的生物信息學分析
        2.1.11 實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）
        2.1.12 WesternBlot實驗
        2.1.13 間接免疫熒光實驗
    2.2 實驗結(jié)果
        2.2.1 CDVPS毒株感染Mv.1.Lu細胞的動力學分析
        2.2.2 差異蛋白的鑒定和定量
        2.2.3 差異蛋白的亞細胞定位注釋
        2.2.4 差異蛋白的GO功能和KEGG通路注釋
        2.2.5 參與免疫應答過程的差異蛋白的互作網(wǎng)絡分析
        2.2.6 差異蛋白的驗證
        2.2.7 CDV感染激活NF-κB信號途徑
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 TLRs對CDV感染誘導的NF-κB激活的影響研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 細胞與病毒
        3.1.2 主要試劑及質(zhì)粒
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要軟件
        3.1.5 引物的設(shè)計與合成
        3.1.6 病毒感染及樣品收集
        3.1.7 RNA提取,cDNA合成和qRT-PCR實驗
        3.1.8 MTT實驗
        3.1.9 抑制效果檢測
        3.1.10 雙熒光素酶檢測實驗
        3.1.11 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 CDV感染誘導TLR3,TLR7,TLR8和NF-κBmRNA表達上調(diào)
        3.2.2 ST2825和TLR3抑制劑的抑制效果分析
        3.2.3 TLRs參與了CDV感染誘導的NF-κB的激活
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 TLR3對CDV復制增殖的影響研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗動物
        4.1.2 細胞與病毒
        4.1.3 主要試劑及抗體
        4.1.4 主要儀器及軟件
        4.1.5 引物的設(shè)計與合成
        4.1.6 水貂脾臟總RNA的提取及cDNA的合成
        4.1.7 水貂TLR3基因中間片段的PCR擴增及序列驗證
        4.1.8 3 ＇RACE和5＇RACEPCR
        4.1.9 水貂TLR3基因全長序列驗證及生物信息學分析
        4.1.10 水貂TLR3基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.11 水貂TLR3基因功能初步分析
        4.1.12 病毒感染過表達TLR3的Mv.1.Lu細胞
        4.1.13 TLR3抑制劑實驗
        4.1.14 Poly（I:C）刺激實驗
        4.1.15 MTT實驗
        4.1.16 雙熒光素酶實驗
        4.1.17 間接免疫熒光實驗
        4.1.18 WesternBlot實驗
        4.1.19 數(shù)據(jù)分析
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 TLR3基因中間片段PCR擴增及3'RACE和5'RACE擴增
        4.2.2 TLR3ORF基因的序列驗證
        4.2.3 水貂TLR3基因編碼蛋白的信號肽,跨膜區(qū)和結(jié)構(gòu)域預測
        4.2.4 水貂TLR3基因的序列分析
        4.2.5 水貂TLR3基因的序列比對和進化樹分析
        4.2.6 pCMV-myc-TLR3表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.7 pCMV-myc-TLR3的表達分析
        4.2.8 pCMV-myc-TLR3的功能初步分析
        4.2.9 過表達TLR3限制CDV復制增殖
        4.2.10 抑制TLR3表達促進CDV復制增殖
        4.2.11 TLR3促進CDV感染中IFN-β和Mx1的表達
        4.2.12 抑制NF-κB激活促進CDV感染和復制
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 全文結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3052026