犬瘟熱病毒（CDV）感染引起的犬瘟熱（CD）是水貂致死性疾病中的主要傳染病之一,給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病沒有有效的治療方法,主要通過疫苗免疫進(jìn)行預(yù)防,但是越來越多的文獻(xiàn)表明,免疫過疫苗的動物仍能夠發(fā)病。如何有效防控CDV感染一直是研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)。病毒與宿主之間的相互平衡和制約決定了疾病進(jìn)程和轉(zhuǎn)歸,因此更好的了解病毒-宿主之間相互作用關(guān)系有助于發(fā)掘潛在的抗病毒靶標(biāo)。本研究首次利用iTRAQ技術(shù)對CDV感染前后的Mv.1.Lu細(xì)胞進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析,并且對TLR3對CDV感染和復(fù)制增殖的影響和作用機(jī)制進(jìn)行了研究,以期為有效防控水貂CDV感染提供一定的理論依據(jù)。為了揭示CDV與水貂細(xì)胞內(nèi)蛋白之間的互作關(guān)系,我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對CDV PS毒株感染前后24 h的Mv.1.Lu細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)變化情況進(jìn)行了分析。共鑒定到520個差異蛋白,包括151個上調(diào)蛋白和369個下調(diào)蛋白。利用DAVID和UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能富集分析表明,差異蛋白參與多種生物學(xué)過程。Network和KEGG通路分析顯示差異蛋白主要涉及NF-κB信號通路,此外還參與了NLRs和TLRs等通路... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：100 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 TLRS介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答
        1.1.1 TLRs的分布及其結(jié)構(gòu)和相應(yīng)配體
        1.1.2 TLRs下游接頭蛋白及其信號途徑
        1.1.3 非TLRs的其他PRRs
    1.2 犬瘟熱病毒（CDV）
        1.2.1 CDV基本特性
        1.2.2 臨床特征
        1.2.3 致病性研究
    1.3 CDV與天然免疫應(yīng)答
        1.3.1 細(xì)胞因子與免疫抑制
        1.3.2 細(xì)胞因子與脫髓鞘腦白質(zhì)炎（DL）
        1.3.3 IFNs與CDV感染
第二章 CDV感染Mv.1.Lu細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 細(xì)胞與病毒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要軟件
        2.1.5 溶液配制
        2.1.6 病毒預(yù)處理
        2.1.7 病毒感染Mv.1.Lu細(xì)胞的動力學(xué)實(shí)驗(yàn)
        2.1.8 用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的樣品制備
        2.1.9 iTRAQ定量
        2.1.10 差異蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析
        2.1.11 實(shí)時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）
        2.1.12 WesternBlot實(shí)驗(yàn)
        2.1.13 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)
    2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.2.1 CDVPS毒株感染Mv.1.Lu細(xì)胞的動力學(xué)分析
        2.2.2 差異蛋白的鑒定和定量
        2.2.3 差異蛋白的亞細(xì)胞定位注釋
        2.2.4 差異蛋白的GO功能和KEGG通路注釋
        2.2.5 參與免疫應(yīng)答過程的差異蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析
        2.2.6 差異蛋白的驗(yàn)證
        2.2.7 CDV感染激活NF-κB信號途徑
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 TLRs對CDV感染誘導(dǎo)的NF-κB激活的影響研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 細(xì)胞與病毒
        3.1.2 主要試劑及質(zhì)粒
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要軟件
        3.1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成
        3.1.6 病毒感染及樣品收集
        3.1.7 RNA提取,cDNA合成和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)
        3.1.8 MTT實(shí)驗(yàn)
        3.1.9 抑制效果檢測
        3.1.10 雙熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)
        3.1.11 數(shù)據(jù)分析
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 CDV感染誘導(dǎo)TLR3,TLR7,TLR8和NF-κBmRNA表達(dá)上調(diào)
        3.2.2 ST2825和TLR3抑制劑的抑制效果分析
        3.2.3 TLRs參與了CDV感染誘導(dǎo)的NF-κB的激活
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 TLR3對CDV復(fù)制增殖的影響研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 試驗(yàn)動物
        4.1.2 細(xì)胞與病毒
        4.1.3 主要試劑及抗體
        4.1.4 主要儀器及軟件
        4.1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成
        4.1.6 水貂脾臟總RNA的提取及cDNA的合成
        4.1.7 水貂TLR3基因中間片段的PCR擴(kuò)增及序列驗(yàn)證
        4.1.8 3 ＇RACE和5＇RACEPCR
        4.1.9 水貂TLR3基因全長序列驗(yàn)證及生物信息學(xué)分析
        4.1.10 水貂TLR3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.1.11 水貂TLR3基因功能初步分析
        4.1.12 病毒感染過表達(dá)TLR3的Mv.1.Lu細(xì)胞
        4.1.13 TLR3抑制劑實(shí)驗(yàn)
        4.1.14 Poly（I:C）刺激實(shí)驗(yàn)
        4.1.15 MTT實(shí)驗(yàn)
        4.1.16 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)
        4.1.17 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        4.1.18 WesternBlot實(shí)驗(yàn)
        4.1.19 數(shù)據(jù)分析
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 TLR3基因中間片段PCR擴(kuò)增及3'RACE和5'RACE擴(kuò)增
        4.2.2 TLR3ORF基因的序列驗(yàn)證
        4.2.3 水貂TLR3基因編碼蛋白的信號肽,跨膜區(qū)和結(jié)構(gòu)域預(yù)測
        4.2.4 水貂TLR3基因的序列分析
        4.2.5 水貂TLR3基因的序列比對和進(jìn)化樹分析
        4.2.6 pCMV-myc-TLR3表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.7 pCMV-myc-TLR3的表達(dá)分析
        4.2.8 pCMV-myc-TLR3的功能初步分析
        4.2.9 過表達(dá)TLR3限制CDV復(fù)制增殖
        4.2.10 抑制TLR3表達(dá)促進(jìn)CDV復(fù)制增殖
        4.2.11 TLR3促進(jìn)CDV感染中IFN-β和Mx1的表達(dá)
        4.2.12 抑制NF-κB激活促進(jìn)CDV感染和復(fù)制
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3052026