副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, HPS）是豬上呼吸道常在條件致病菌,在宿主免疫力低下時引發(fā)格拉瑟氏病,主要剖檢病變是：多發(fā)性漿液性纖維素性胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。近年來該病的發(fā)生導致全球范圍養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟損失。為了有針對性地制定出高效的綜合防治策略必須對該菌的分子致病機理進行剖析闡釋。本研究以HPS細胞膨脹致死毒素（Cytolethal distending toxin, CDT）和假定的絲氨酸蛋白酶EspPs（包括EspP1和EspP2）為研究對象。它們都是HPS中已有報道的潛在的致病因子。以往對細胞膨脹致死毒素的研究多采用體外分析的方法,而體內(nèi)研究的報道較少,而且在HPS中也沒有CDT導致細胞凋亡的報道。IgA蛋白酶在逃避宿主天然免疫中發(fā)揮著重要作用,曾在流感嗜血桿菌等細菌中有報道,最近發(fā)現(xiàn)某些HPS菌株的分泌蛋白有IgA蛋白酶活性,但是還沒有在HPS中發(fā)現(xiàn)和流感嗜血桿菌的IgA蛋白酶同源的基因,蛋白結(jié)構(gòu)分析和基因序列分析發(fā)現(xiàn)HPS菌株SH0165中的假定的絲氨酸蛋白酶EspPs有可能是IgA蛋白酶。本研究主要取得的研究結(jié)果如卜：1.構(gòu)建... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第1章 文獻綜述
    1.1 副豬嗜血桿菌概述
        1.1.1 HPS培養(yǎng)及生化特性
        1.1.2 HPS的血清學分型和基因分型
        1.1.3 HPS的功能基因
        1.1.4 格拉瑟氏病的防控
    1.2 細胞致死膨脹毒素（CDT）致病作用的研究進展
        1.2.1 CDT對細胞的致病作用
        1.2.2 CDT在細菌性傳染病中的致病作用
    1.3 自然轉(zhuǎn)化研究進展
        1.3.1 自然轉(zhuǎn)化的研究歷史
        1.3.2 自然轉(zhuǎn)化的機制
        1.3.3 自然轉(zhuǎn)化用于基因缺失突變株構(gòu)建
    1.4 IgA蛋白酶研究進展
        1.4.1 IgA蛋白酶的結(jié)構(gòu)特征
        1.4.2 IgA蛋白酶的生物學功能
第2章 HPS細胞致死膨脹毒素的致病作用研究
    2.1 前言
    2.2 試驗材料
        2.2.1 細菌、質(zhì)粒與細胞
        2.2.2 主要的酶與試劑盒
        2.2.3 主要細菌、細胞培養(yǎng)基及配制
        2.2.4 主要的細胞試驗相關(guān)溶劑及配制
        2.2.5 Western blot相關(guān)試劑及配制
        2.2.6 Southern blot相關(guān)試劑及配制
        2.2.7 主要的實驗室器材
        2.2.8 引物
        2.2.9 實驗動物
    2.3 試驗方法
R,oriT,sacB）的擴增,測序與保存">        2.3.1 pK18mobsacB（Km^R,oriT,sacB）的擴增,測序與保存
1G的構(gòu)建">        2.3.2 pK18-C₁G的構(gòu)建
2K的構(gòu)建">        2.3.3 pK18-C₂K的構(gòu)建
        2.3.4 HPS模型菌株的篩選
        2.3.5 自然轉(zhuǎn)化法篩選基因缺失突變株及突變株檢測
        2.3.6 缺失菌株和野生菌株生長曲線的測定
        2.3.7 野生菌株和缺失菌株分泌蛋白和全菌蛋白的提取
        2.3.8 CDT分泌蛋白和菌體蛋白對PK15細胞形態(tài)的影響
        2.3.9 HPS CDT與細胞凋亡的關(guān)系
        2.3.10 HPS CDT對豚鼠的致病作用
    2.4 結(jié)果與分析
1G的構(gòu)建">        2.4.1 質(zhì)粒pK18-C₁G的構(gòu)建
2K的構(gòu)建">        2.4.2 質(zhì)粒pK18-C₂K的構(gòu)建
        2.4.3 自然轉(zhuǎn)化法篩選cdt基因缺失突變株及突變株鑒定
        2.4.4 缺失菌株和野生菌株生長曲線的測定
        2.4.5 CDT對PK15形態(tài)的影響
        2.4.6 CDT對細胞凋亡的作用
        2.4.7 HPS CDT對豚鼠的致病作用
    2.5 討論
        2.5.1 自然轉(zhuǎn)化法構(gòu)建cdt缺失突變株
        2.5.2 HPS CDT對細胞的致病作用
        2.5.3 HPS CDT對豚鼠的致病作用
第3章 絲氨酸蛋白酶EspPs的IgA蛋白酶活性研究
    3.1 前言
    3.2 試驗材料
        3.2.1 主要的菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 用于蛋白表達純化的主要試劑
        3.2.3 用于IgA切割試驗的蛋白和試劑
        3.2.4 Western blot相關(guān)試劑
    3.3 試驗方法
        3.3.1 重組蛋白EspP2pd的原核表達和純化
        3.3.2 HPS分泌蛋白的提取
        3.3.3 IgA切割試驗
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 重組蛋白EspP2pd在E.coli BL21（DE3）中的表達和純化
        3.4.2 IgA切割試驗
        3.4.3 IgA切割試驗最佳切割時間的確定
        3.4.4 IgA切割試驗與蛋白的劑量依賴性
    3.5 討論
結(jié)論
參考文獻
附錄
附圖
致謝



本文編號：3045098