在體外培養(yǎng)條件下，正常組織來源的細(xì)胞通常經(jīng)過有限次的傳代后，就會(huì)停止分裂增殖，發(fā)生衰老和死亡。原代豬小腸上皮細(xì)胞（pSIECs）與其他正常組織來源的細(xì)胞一樣，在體外經(jīng)過8～13次的傳代后，就停止分裂增殖。豬輪狀病毒（Porcine rotavirus, PRV）是引起仔豬腹瀉的主要病原之一，在體外，輪狀病毒雖可吸附于多種細(xì)胞，但只感染來源于腸道上皮的細(xì)胞和腎細(xì)胞。輪狀病毒的吸附和感染過程需要胰蛋白酶的參與來增加病毒對宿主細(xì)胞的感染性，通常在無血清的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。然而，原代小腸上皮細(xì)胞對無血清培養(yǎng)極其敏感。另外，原代小腸上皮細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)也相當(dāng)困難。盡管使用異源性細(xì)胞培養(yǎng)模型也可以獲得很多有價(jià)值的信息，但是這些細(xì)胞可能不能應(yīng)用于豬，因?yàn)椴煌妮啝畈《局昃哂蟹N屬差異性，細(xì)胞受體及因子的差別都會(huì)影響輪狀病毒的吸附、感染、復(fù)制及致病性。這些難題阻礙了對豬輪狀病毒（PRV）致病機(jī)理研究的進(jìn)程。因此，研究輪狀病毒的致病機(jī)理，同源性宿主細(xì)胞的獲得極其必要。本研究的目的是通過轉(zhuǎn)染外源基因的辦法延長體外培養(yǎng)的豬小腸上皮細(xì)胞的壽命，建立具有正常上皮細(xì)胞形態(tài)和功能的永生化豬小腸上皮細(xì)胞系，然后研究豬輪... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：145 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    第一章 腸上皮細(xì)胞與細(xì)胞永生化
        1.1 腸上皮細(xì)胞與免疫
            1.1.1 小腸上皮與疾病發(fā)生
            1.1.2 上皮細(xì)胞影響腸道免疫細(xì)胞
            1.1.3 腸上皮細(xì)胞引發(fā)腸道內(nèi)的免疫耐受
            1.1.4 免疫細(xì)胞影響腸道上皮細(xì)胞
            1.1.5 腸上皮細(xì)胞的調(diào)控與炎癥發(fā)生
        1.2 端粒酶活化與細(xì)胞永生化
            1.2.1 細(xì)胞衰老和端粒損傷
            1.2.2 端粒酶與衰老
            1.2.3 端粒酶活性與抗衰老
    第二章 輪狀病毒研究進(jìn)展
        2.1 輪狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性
            2.1.1 輪狀病毒的基因組結(jié)構(gòu)
            2.1.2 輪狀病毒的分類
            2.1.3 輪狀病毒的復(fù)制周期
        2.2 輪狀病毒的致病機(jī)制
        2.3 NSP4 蛋白在輪狀病毒復(fù)制和致病中的作用
            2.3.1 NSP4 的結(jié)構(gòu)和膜拓?fù)鋵W(xué)
            2.3.2 NSP4 受體活性
            2.3.3 NSP4 與胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）內(nèi)穩(wěn)態(tài)
            2.3.4 NSP4 與細(xì)胞蛋白的相互作用
            2.3.5 NSP4 作為腸毒素的釋放
        2.4 Viroporin 的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性
            2.4.1 Viroporin 的結(jié)構(gòu)分類
            2.4.2 Viroporin 的細(xì)胞病變效應(yīng)
            2.4.3 膜重塑及糖蛋白的運(yùn)輸
            2.4.4 Viroporin 與病毒生命周期
            2.4.5 Viroporin 的孔形成活性
試驗(yàn)研究
    第三章 永生化豬小腸上皮細(xì)胞系的建立
        3.1 材料
            3.1.1 細(xì)胞、菌株與質(zhì)粒
            3.1.2 主要試劑
            3.1.3 主要儀器與設(shè)備
        3.2 方法
            3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)液配方
            3.2.2 pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與鑒定
            3.2.3 pCI-neo-hTERT 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬小腸上皮細(xì)胞
            3.2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞鑒定
            3.2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長特性的檢測
            3.2.6 RT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中外源性 hTERT 基因的表達(dá)
            3.2.7 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化特征鑒定
            3.2.8 HE 染色
            3.2.9 轉(zhuǎn)染細(xì)胞端粒酶活性檢測
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 pCI-neo-hTERT 測序鑒定
            3.3.2 豬小腸上皮細(xì)胞最佳 G418 篩選濃度確定
            3.3.3 轉(zhuǎn)染后陽性克隆的獲得
            3.3.4 形態(tài)學(xué)鑒定
            3.3.5 SIEC02 細(xì)胞的腸上皮特征鑒定
            3.3.6 生長曲線和細(xì)胞周期與凋亡
            3.3.7 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的 hTERT 基因的 RT-PCR 檢測
            3.3.8 端粒酶活性檢測
            3.3.9 SIEC02 細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力分析
            3.3.10 接觸抑制性
            3.3.11 細(xì)胞增殖分析
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 永生化豬小腸上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性研究
        4.1 材料
            4.1.1 主要試劑和細(xì)菌
            4.1.2 主要儀器設(shè)備
        4.2 方法
            4.2.1 細(xì)菌侵染
            4.2.2 細(xì)菌黏附
            4.2.3 免疫刺激
            4.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測免疫相關(guān)基因
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 細(xì)菌對永生化豬小腸上皮細(xì)胞的黏附試驗(yàn)
            4.3.2 細(xì)菌侵染效率檢測
            4.3.3 SIEC02 細(xì)胞對沙門菌感染與 LPS 刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的檢測
            4.3.4 血清對 SIEC02 細(xì)胞的影響
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
    第五章 豬輪狀病毒對永生化豬小腸上皮細(xì)胞的影響
        5.1 材料
            5.1.1 細(xì)胞及其培養(yǎng)條件
            5.1.2 病毒
            5.1.3 主要試劑
            5.1.4 主要儀器
        5.2 方法
            5.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
            5.2.2 病毒復(fù)壯與增殖
            5.2.3 豬輪狀病毒感染 SIEC02 細(xì)胞
            5.2.4 細(xì)胞活力檢測
            5.2.5 豬輪狀病毒致細(xì)胞病變作用的檢測
            5.2.6 直接免疫熒光檢測病毒蛋白的表達(dá)
            5.2.7 Hochest 33258 染色檢測
            5.2.8 ELISA 檢測細(xì)胞凋亡
            5.2.9 TUNEL 檢測早期細(xì)胞凋亡
            5.2.10 透射電鏡檢測
            5.2.11 流式細(xì)胞儀檢測凋亡
            5.2.12 線粒體膜電位檢測
        5.3 結(jié)果
            5.3.1 豬輪狀病毒對 SIEC02 活力影響
            5.3.2 豬輪狀病毒誘導(dǎo) SIEC02 細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變
            5.3.3 流式細(xì)胞儀檢測病毒蛋白的表達(dá)
            5.3.4 透射電鏡結(jié)果
            5.3.5 豬輪狀病毒誘導(dǎo)的凋亡
        5.4 討論
        5.5 小結(jié)
    第六章 豬輪狀病毒 NSP4 蛋白的亞細(xì)定位及對豬小腸上皮細(xì)胞凋亡的影響
        6.1 材料
            6.1.1 材料
            6.1.2 試劑和抗體
            6.1.3 主要儀器
        6.2 方法
            6.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)
            6.2.2 病毒增殖和感染
            6.2.3 引物設(shè)計(jì)
            6.2.4 基于 NSP4 基因相關(guān) DNA 片段的載體構(gòu)建
            6.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 SIEC02 細(xì)胞
            6.2.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位載體 pDsred-ER 單克隆細(xì)胞的構(gòu)建
            6.2.7 亞細(xì)胞定位
            6.2.8 Western blot 分析
            6.2.9 Real-time PCR
        6.3 結(jié)果
            6.3.1 PCR 擴(kuò)增及重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果
            6.3.2 豬輪狀病毒 NSP4 viroporin 蛋白及其兩翼結(jié)構(gòu)亞細(xì)胞共定位
            6.3.3 NSP4 蛋白及其 viroporin 對 caspase-3、Bax 和 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平影響
            6.3.4 NSP4 蛋白及其 viroporin 對 caspase-8 和 caspase-9 蛋白水平影響
            6.3.5 NSP4 蛋白及其 viroporin 對 Bax 和 Bcl-2 轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平影響
        6.4 討論
        6.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
縮略詞
致謝
個(gè)人簡介



本文編號：3044654