銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又稱綠膿桿菌,廣泛分布在自然界中,其感染的疾病類型多樣化。致死率很高并且對多種抗生素具有耐藥性,給臨床治療帶來很大的困難。疫苗成為預(yù)防銅綠假單胞菌多種感染的有效方法。本研究根據(jù)已報道的銅綠假單胞菌OprF基因和銅綠假單胞菌OprI基因,利用融合PCR技術(shù)擴(kuò)增兩個片段的融合基因OprF190-342-OprI21–83進(jìn)行原核表達(dá),得到大小為25.2ku的融合蛋白,以此純化蛋白為抗原建立了銅綠假單胞菌OprF/I蛋白間接ELISA方法。不同佐劑與純化后OprF/I蛋白充分混合后免疫實驗小鼠,檢測小鼠血清中特異性抗體水平。主要研究內(nèi)容如下:1.根據(jù)已報道的銅綠假單胞菌OprF基因（GenBank:JX040481.1）和OprI基因（GenBank:X58714.1）,利用PCR技術(shù),分別克隆出OprF190-342、OprI21–83以及融合基因OprF190-342-OprI21–83,片段大小分別為495bp、207bp和663bp。2.銅綠假單胞菌外膜蛋白的原核表達(dá)及純化。根據(jù)克隆的基因片段OprF、OprI、OprF/I... 

【文章來源】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉林省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 銅綠假單胞菌概述
    1.2 銅綠假單胞菌疫苗
        1.2.1 滅活疫苗
        1.2.2 減毒活疫苗
        1.2.3 DNA疫苗
        1.2.4 結(jié)合疫苗
    1.3 免疫佐劑
        1.3.1 礦物質(zhì)類佐劑
        1.3.2 弗氏佐劑
        1.3.3 免疫刺激復(fù)合物及基質(zhì)
        1.3.4 細(xì)胞因子佐劑
        1.3.5 多糖佐劑
        1.3.6 人參皂苷佐劑
第二章 水貂銅綠假單胞菌外膜蛋白OprF、OprI及OprF/I基因的克隆及表達(dá)
    2.1 材料與方法
        2.1.1 菌種與載體
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 引物設(shè)計及合成
        2.1.5 基因片段OprF、OprI、OprF’、OprI’的PCR擴(kuò)增
        2.1.6 基因片段OprF、OprI、OprF’、OprI’ PCR產(chǎn)物的回收
        2.1.7 基因片段OprF/I的PCR擴(kuò)增
        2.1.8 基因片段OprF/I PCR產(chǎn)物的回收
        2.1.9 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1.10 重組克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli TransT1
        2.1.11 重組克隆質(zhì)粒的提取
        2.1.12 重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定
        2.1.13 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.1.14 重組克隆質(zhì)粒的測序鑒定
        2.1.15 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.1.16 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Trans T1
        2.1.17 重組表達(dá)質(zhì)粒的提取
        2.1.18 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定
        2.1.19 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.1.20 重組表達(dá)質(zhì)粒的測序鑒定
        2.1.21 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21
        2.1.22 重組表達(dá)質(zhì)粒的提取與鑒定
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 基因片段OprF、OprI、OprF/I的擴(kuò)增
        2.2.2 重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定
        2.2.3 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.2.4 重組克隆質(zhì)粒的測序鑒定
        2.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定
        2.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.2.7 重組表達(dá)質(zhì)粒的測序鑒定
    2.3 討論
    2.4 本章小結(jié)
第三章 水貂銅綠假單胞菌外膜蛋白的原核表達(dá)及純化
    3.1 材料與方法
        3.1.1 主要試劑
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中最適表達(dá)條件的篩選
        3.1.4 SDS-PAGE分析
        3.1.5 OprF/I、OprF、OprI的大量表達(dá)
        3.1.6 OprF/I、OprF、OprI的分離純化
        3.1.7 Western blot分析
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中最適表達(dá)條件的研究
        3.2.2 純化產(chǎn)物OprF/I、OprF、OprI的SDS-PAGE分析
        3.2.3 Western blot分析
    3.3 討論
    3.4 本章小結(jié)
第四章 銅綠假單胞菌外膜蛋白及全菌間接ELISA方法的初步建立與比較
    4.1 材料與方法
        4.1.1 主要儀器
        4.1.2 試驗試劑
        4.1.3 試驗方法
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 抗原濃度測定
        4.2.2 間接ELISA最佳反應(yīng)條件
    4.3 討論
    4.4 本章小結(jié)
第五章 銅綠假單胞菌外膜蛋白OprF/I的免疫效果評價
    5.1 材料與方法
        5.1.1 試驗儀器
        5.1.2 主要試劑及實驗動物
        5.1.3 抗原制備
        5.1.4 動物分組及免疫程序
        5.1.5 小鼠血清的抗體檢測
        5.1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析
    5.2 結(jié)果與分析
    5.3 討論
    5.4 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡介
致謝



本文編號：3040293