降低反芻動物甲烷的排放,不僅能提高其對飼料的利用率,還可以減輕溫室效應(yīng),緩解氣候變暖,具有重要的生產(chǎn)實踐意義和環(huán)境保護意義,但目前還缺乏行之有效的技術(shù)手段。本試驗將產(chǎn)甲烷短桿菌M1中編碼膜蛋白EhaF的基因在大腸桿菌中表達,并研究表達產(chǎn)物免疫山羊后對山羊甲烷排放量和瘤胃古菌結(jié)構(gòu)和組成的影響。先從產(chǎn)甲烷短桿菌Methanobrevibacter ruminantium M1全基因序列的適合于克隆和異源表達抗原蛋白的基因中,挑選出候選的抗原基因mru1407。以山羊瘤胃微生物DNA為模板,通過PCR擴增到候選基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a（+）-mrul407,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosseta中進行表達,利用Ni-NTA分離純化出表達的重組蛋白EhaF,用質(zhì)譜分析檢測純化蛋白EhaF的氨基酸序列。挑選12只健康山羊作為試驗動物,按照體重相近原則將其分為對照組與免疫組,每組設(shè)6個重復(fù),每個重復(fù)1頭羊。所有試驗動物統(tǒng)一飼喂精粗比為3：7的全混合日糧,經(jīng)14天預(yù)飼期后開始正式試驗。正式試驗的第0天對照組注射1ml佐劑與1ml洗脫液組成的混合液,免疫組注射含4001μg重組蛋白EhaF的1ml洗脫... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
引言
第一章 文獻綜述
    1. 瘤胃甲烷排放及調(diào)控措施
        1.1 瘤胃產(chǎn)甲烷菌
        1.2 瘤胃甲烷產(chǎn)生途徑
        1.3 瘤胃甲烷減排的調(diào)控措施
            1.3.1 調(diào)控日糧結(jié)構(gòu)
            1.3.2 添加有機酸
            1.3.3 添加脂質(zhì)
            1.3.4 使用添加劑
            1.3.5 免疫調(diào)控
    2. 產(chǎn)甲烷重組蛋白疫苗
        2.1 反向疫苗學(xué)
        2.2 產(chǎn)甲烷菌廣譜抗原基因的篩選
        2.3 EhaF
    3. 高通量測序在瘤胃產(chǎn)甲烷菌研究上的應(yīng)用
        3.1 Roche GS FLX+system
        3.2 Ion Torrent PGM
        3.3 Miseq測序的Illumina
    4 存在的問題及本研究的目的意義
        4.1 存在的問題
        4.2 本研究的目的及意義
第二章：試驗研究
    試驗一：重組蛋白的異源表達及純化、鑒定
        1. 材料
            1.1 試驗材料
                1.1.1 目的基因：mru1407
                1.1.2 菌株及載體
            1.2 主要儀器和設(shè)備
            1.3 生物信息軟件
            1.4 試劑
        2. 試驗方法
            2.1 目的基因克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.1.1 引物設(shè)計
                2.1.2 PCR擴增目的基因
                2.1.3 PCR產(chǎn)物回收
                2.1.4 PCR產(chǎn)物及pET30a（+）雙酶切
                2.1.5 酶切產(chǎn)物膠回收及產(chǎn)物連接
                2.1.6 大腸桿菌Top10感受態(tài)的制備
                2.1.7 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
                2.1.8 陽性克隆鑒定
            2.2 表達菌株的構(gòu)建
                2.2.1 大腸桿菌Rosetta感受態(tài)的制備
                2.2.2 陽性克隆子及空載的轉(zhuǎn)化及鑒定
            2.3 重組質(zhì)粒在ROSETTA的表達
                2.3.1 小規(guī)模重組質(zhì)粒表達
                2.3.2 重組蛋白EhaF的純化
                2.3.3 重組蛋白SDS-PAGE條帶的質(zhì)譜分析
                2.3.4 大規(guī)模重組質(zhì)粒表達
        3. 結(jié)果
            3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.2 重組質(zhì)粒PET30A（+）·MRU1407的表達
            3.3 重組蛋白的純化及鑒定
        4. 討論
            4.1 表達載體的構(gòu)建及蛋白的表達
            4.2 蛋白的純化及鑒定
        5. 小結(jié)
    試驗二：重組蛋白EhaF免疫山羊及免疫效果評價
        1. 材料
            1.1 試驗材料
                1.1.1 重組蛋白EhaF
                1.1.2 試驗動物
            1.2 試驗日糧
            1.3 主要儀器和設(shè)備
            1.4 試劑
            1.5 生物信息學(xué)分析軟件及數(shù)據(jù)庫
        2. 方法
            2.1 重組蛋白EhaF免疫山羊
                2.1.1 試驗準備
                2.1.2 免疫程序及采樣時間
                2.1.3 樣品采集方法
            2.2 抗體滴度檢測
            2.3 甲烷排放量檢測
            2.4 提取瘤胃微生物總DNA
            2.5 Miseq測序
            2.6 數(shù)據(jù)分析
        3. 結(jié)果
            3.1 血液指標
            3.2 清、唾液及瘤胃液抗體滴度
            3.3 甲烷排放量
            3.4 Miseq測序
                3.4.1 稀釋曲線
                3.4.2 物種注釋
                3.4.3 Alpha多樣性
                3.4.4 產(chǎn)甲烷菌屬豐度的比對
        4. 討論
            4.1 血液生化指標及血常規(guī)
            4.2 血清、唾液瘤胃液抗體滴度
            4.3 甲烷排放量
            4.4 稀釋曲線
            4.5 物種注釋
            4.6 Alpha多樣性
            4.7 產(chǎn)甲烷菌豐度的對比
        5. 小結(jié)
第三章：結(jié)論及創(chuàng)新點
    1. 結(jié)論
    2. 創(chuàng)新點
    3. 需進一步研究的問題
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3036750