多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida, Pm）是一種廣泛流行于世界各地的病原菌,自然宿主十分廣泛。在豬群中能夠引起豬萎縮性鼻炎（Atrophic rhinitis, AR）和豬肺疫（Swine plague, SP）,在禽、牛、羊以及家兔等動(dòng)物中會(huì)引起出血性敗血癥（Haemorrhagic septicaemia, HS）,給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前預(yù)防多殺性巴氏桿菌以免疫接種為主,疫苗類型主要分為以下幾種：強(qiáng)毒滅活疫苗,弱毒活疫苗,亞單位疫苗。這些疫苗能在一定程度上對(duì)多殺性巴氏桿菌起到預(yù)防的作用,但是多殺性巴氏桿菌血清型很多,不同血清型菌株之間缺乏相互交叉的免疫保護(hù),導(dǎo)致目前應(yīng)用的疫苗免疫效果不夠理想。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,利用病原菌的抗原蛋白制備的亞單位疫苗是當(dāng)前疫苗研究熱點(diǎn),亞單位疫苗的理想抗原應(yīng)該具有：抗原性高,免疫原性強(qiáng),安全性高等特點(diǎn)。以往理想抗原的篩選較為困難,隨著蛋白組學(xué)技術(shù)：2-DE電泳和質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展,尤其是結(jié)合免疫印跡技術(shù)的免疫蛋白組學(xué)為篩選新型免疫保護(hù)性抗原,應(yīng)用于研制新型高效亞單位疫苗提供了重要途徑。蛋白組學(xué)技術(shù)的開發(fā)... 

【文章來(lái)源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表（Abbreviation ）
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 多殺性巴氏桿菌的生物學(xué)特性
    1.2 多殺性巴氏桿菌的危害與防治
    1.3 蛋白組學(xué)及研究方法
    1.4 免疫蛋白組學(xué)與細(xì)菌表面蛋白
    1.5 亞單位疫苗
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 菌株和試驗(yàn)動(dòng)物
    3.2 pET-30a質(zhì)粒和pMD-18T
    3.3 主要試劑
    3.4 主要緩沖液的配方
    3.5 免疫蛋白的篩選
        3.5.1 菌株的選取與培養(yǎng)
        3.5.2 菌株的定量與保存
        3.5.3 感染血清與對(duì)照血清
        3.5.4 ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)
        3.5.5 細(xì)菌表面蛋白的提取
        3.5.6 SDS-PAGE電泳
        3.5.7 蛋白定量
        3.5.8 雙向電泳分離
        3.5.9 銀染
        3.5.10 Westren b1ot
        3.5.11 蛋白酶解
        3.5.12 MALDI-TOF質(zhì)譜分析
        3.5.13 PGAM基因gpmA引物設(shè)計(jì)與合成
    3.6 PGAM蛋白表達(dá)及純化
        3.6.1 PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序
        3.6.2 PCR產(chǎn)物回收
        3.6.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.6.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.6.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.6.6 質(zhì)粒的小量制備
        3.6.7 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.6.8 表達(dá)菌株的構(gòu)建
        3.6.9 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        3.6.10 蛋白純化
    3.7 PGAM蛋白功能研究
        3.7.1 PGAM蛋白對(duì)巴氏桿菌生長(zhǎng)影響
        3.7.2 HN06對(duì)小鼠的半數(shù)致死性試驗(yàn)（寇氏（Korbor）法）
        3.7.3 PGAM蛋白免疫Km小鼠及抗體檢測(cè)與攻毒
4 結(jié)果與分析
    4.1 HN06新型免疫蛋白的鑒定
        4.1.1 HN06瓊脂糖凝膠相關(guān)基因鑒定
        4.1.2 HN06感染血清抗體滴度測(cè)定
        4.1.3 SDS-PAGE檢測(cè)表面蛋白
        4.1.4 2-DE電泳及western blot
        4.1.5 質(zhì)譜鑒定結(jié)果
        4.1.6 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)
    4.2 PGAM蛋白的重組表達(dá)純化及活性鑒定
        4.2.1 gpmA基因的克隆及連接鑒定
        4.2.2 測(cè)序鑒定
        4.2.3 重組蛋白PGAM表達(dá)與純化
        4.2.4 重組蛋白PGAM免疫活性檢測(cè)
    4.3 PGAM蛋白的功能研究
        4.3.1 PGAM蛋白對(duì)巴氏桿菌生長(zhǎng)影響
        4.3.2 HN06小鼠半數(shù)致死量LD50測(cè)定
        4.3.3 細(xì)菌-20℃保存曲線
        4.3.4 PGAM免疫保護(hù)力的測(cè)定
        4.3.5 PGAM抗體誘導(dǎo)水平探測(cè)
5 討論
    5.1 多殺性巴氏桿菌HN06株新型免疫蛋白鑒定
    5.2 PGAM的功能預(yù)測(cè)及表達(dá)與純化
    5.3 PGAM對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響及免疫功能研究
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄. 個(gè)人簡(jiǎn)歷
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3034273