豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥（postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）的主要病原。組織中高含量的病毒血癥、PCV2病毒載量、肉芽腫性炎癥、淋巴細(xì)胞減少和因免疫抑制造成的淋巴系統(tǒng)功能紊亂是嚴(yán)重感染PCV2的特征。目前預(yù)防豬圓環(huán)病毒2型感染的主要手段是疫苗接種。我國PCV2商品化疫苗包括全病毒滅活疫苗、原核系統(tǒng)表達(dá)的病毒樣顆粒（VLP）疫苗、桿狀病毒載體系統(tǒng)表達(dá)的亞單位疫苗等,但普遍存在的問題是滅活疫苗和亞單位疫苗抗原量不高,或是純化抗原中內(nèi)毒素殘存量較多,導(dǎo)致免疫效果低下及副作用明顯;很多大型豬場選擇采用進(jìn)口疫苗,但進(jìn)口疫苗價格昂貴。為解決這些問題或缺陷,本研究采用Bac-to-Bac^TM桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng),構(gòu)建了高效表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組桿狀病毒。本研究的主要內(nèi)容如下:1對轉(zhuǎn)移載體pFastBacI進(jìn)行了改造,即polh啟動子后連接了另一個啟動子,采用了雙啟動子策略;同時,在polh啟動子上游增加了同源增強(qiáng)子調(diào)控元件。2 C... 

【文章來源】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉林省

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PCV2基因組圖解

圖 2.1 pFastBacI 轉(zhuǎn)移載體Fig.2.1 pFastBacI transfer vector霉素、四環(huán)素、慶大霉素、IPTG 和 X烯酰胺溶液購自 CWBIO 公司；轉(zhuǎn)膜司；一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)搖DS-PAGE loading buffer、10×DNAloaap、高保真 PrimeSTAR Max Premix 和KaRa 公司；KpnI、XbaI 限制性內(nèi)切酶Agel Extraction kit 及 Body Fluid Viral；轉(zhuǎn)染試劑 TransIT -LTI 購自 MIRU術(shù)研究所；血球計(jì)數(shù)板購自百泰貿(mào)易天生物技術(shù)公司；鼠抗 His 單克隆抗自康為世紀(jì)公司。

圖 2.2 重組桿狀病毒構(gòu)建路線Fig.2.2 The generation of recombinant baculovirus2.2 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)Sf9 細(xì)胞系：在一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿中傳代，使用含有 10%熱滅活胎牛血清的00TMII 培養(yǎng)基，在 27℃的溫濕培養(yǎng)箱（無需補(bǔ)充 5% CO2氣體）中靜置培養(yǎng)，時，使用無菌槍頭輕輕吹起細(xì)胞，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，2～3 天進(jìn)行一次傳代。H5 細(xì)胞系：使用無菌搖瓶在 27℃、110rpm 的搖床上懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基為無的 Sf-900TMII，2～3 天進(jìn)行一次傳代。2.3 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒改造依據(jù)H5細(xì)胞對密碼子的偏好性，PCV2 Cap基因于金唯智公司進(jìn)行了優(yōu)化，成了含有增強(qiáng)子、雙啟動子和 Cap 的基因片段（如圖 2.3）。根據(jù)優(yōu)化后 Cap序列和載體序列設(shè)計(jì)了含有轉(zhuǎn)移載體同源臂的 Cap 基因引物，以及鑒定重移質(zhì)粒的 pFastBacI 載體通用引物和鑒定重組桿粒的通用引物 M13（見表

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]動物疫苗中常用抗原滅活劑的研究進(jìn)展[J]. 徐守振,尹燕博,王新.  中國畜牧獸醫(yī). 2010(09)
[2]Baculovirus as a highly efficient expression vector in insect and mammalian cells[J]. Yu-chen HU~1 Department of Chemical Engineering,National Tsing Hua University,Hsinchu,Taiwan,China.  Acta Pharmacologica Sinica. 2005(04)



本文編號：3023513