發(fā)布時間：2021-02-07 20:01

　　啟動子是控制基因轉錄的調控片段。組織特異性啟動子是在特定組織和器官中特異性表達基因的啟動子。組織特異性啟動子在遺傳育種及性狀改良等應用方面顯示出極高的價值。本試驗采用豬肌肉特異性基因MyoG的啟動子驅動與脂質代謝密切相關的過氧化物酶體增殖物激活受體基因在肌肉中異位表達;采用豬肝臟特異性基因α1-AT啟動子以及α1-AT基因的信號肽驅動來源于扣囊復膜酵母的β-葡萄糖苷酶基因在肝臟中異位表達。為構建轉基因小鼠模型提供一定的理論基礎。取得的主要研究成果如下:1.采用在線軟件MEME比對豬、人和小鼠相同區(qū)域序列,確定豬MyoG啟動子的功能區(qū)域位于第一外顯子5端附近�？寺∝iMyoG基因5’側翼806bp序列,TESS和TFSEARCH等分析該片段含有啟動子的特征元件TATA box和多個轉錄因子結合位點,如Sp1、E-box、C/EBP、NF-1、Myogenin等。構建含有MyoG啟動子的pGL3-MyoG報告質粒,分別轉染分化Od、2d、3d、4d、6d的C2C12細胞和3T3-L1細胞。發(fā)現(xiàn)MyoG啟動子活性在C2C12細胞分化3天時達到最大,隨著分化時間的延長,其活性逐漸降低;在3T3-... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 引言
    2 啟動子簡介
        2.1 啟動子的結構
        2.2 啟動子的研究方法
            2.2.1 基于生物信息學的啟動子分析
            2.2.2 啟動子克隆方法
            2.2.3 研究啟動子功能的實驗方法
        2.3 啟動子的應用
            2.3.1 應用于轉基因動物
            2.3.2 應用于RNA干擾
            2.3.3 臨床治療中的應用
    3 MyoG/α1-AT啟動子及CKM增強子研究進展
        3.1 MyoG啟動子研究進展
        3.2 α1-AT啟動子研究進展
        3.3 CKM增強子研究現(xiàn)狀
    4 PPARγ的概述
    5 BGL1研究現(xiàn)狀
    6 研究目的和意義
第二章 材料與方法
    1 試驗材料
        1.1 DNA樣品
        1.2 載體和菌株
        1.3 試劑及其配置
            1.3.1 主要試劑
            1.3.2 試劑的配置
        1.4 主要數(shù)據(jù)庫及分析軟件
    2 試驗方法
        2.1 豬MyoG基因啟動子的克隆及重組表達質粒的構建
            2.1.1 豬基因組提取DNA及質量鑒定
            2.1.2 豬MyoG調控序列的獲得
            2.1.3 PCR擴增產(chǎn)物的檢測和回收
                2.1.3.1 PCR產(chǎn)物的檢測
                2.1.3.2 PCR產(chǎn)物的回收及純化
            2.1.4 克隆載體的構建及酶切回收
                2.1.4.1 PCR產(chǎn)物連接pMD18-T
                2.1.4.2 重組質粒轉化
                2.1.4.3 陽性克隆的檢測及測序
                2.1.4.4 連接pMD18-T質粒小量提取
            2.1.5 pGL3-MyoG重組表達質粒的構建
                2.1.5.1 pMD18-T及pGL3-Basic載體雙酶切及回收
                2.1.5.2 pGL3-Basic重組表達質粒的構建
                2.1.5.3 重組質粒的去內(nèi)毒素小量提取及雙酶切鑒定
        2.2 細胞培養(yǎng)及誘導分化
            2.2.1 細胞的復蘇
            2.2.2 細胞的常規(guī)培養(yǎng)
            2.2.3 細胞凍存
            2.2.4 C2C12細胞的誘導分化
        2.3 細胞轉染及雙熒光素酶活性的測定
            2.3.1 細胞的轉染
            2.3.2 雙熒光素酶相對活性的檢測
                2.3.2.1 細胞裂解
                2.3.2.2 雙熒光素酶活性的檢測及計算
            2.3.3 數(shù)據(jù)的處理及分析
        2.4 真核表達載體以及MyoG突變載體構建
            2.4.1 轉錄因子MyoD真核表達質粒的鑒定
            2.4.2 pcDNA3.1-EGFP真核表達質粒的構建
            2.4.3 MyoG突變載體的構建
        2.5 EMSA驗證MyoD結合位點的存在
            2.5.1 制備探針
            2.5.2 核蛋白提取
            2.5.3 凝膠遷移試驗
        2.6 MyoG啟動子與PPARy重組質粒的構建
            2.6.1 豬PPARγ基因CDS區(qū)域的克隆
            2.6.2 PPARγ與pGL3-MyoG重組質粒的鑒定
        2.7 PPARγ基因在C2C12細胞中表達量的測定
            2.7.1 小鼠C2C12細胞RNA的提取及反轉錄
            2.7.2 定量PCR分析PPARγ在C2C12細胞中的表達量
            2.7.3 C2C12細胞蛋白質的提取
            2.7.4 Western Blot檢測目的蛋白質的表達量
                2.7.4.1 SDS-PAGE電泳
                2.7.4.2 轉膜
                2.7.4.3 抗原抗體免疫反應
        2.8 肌肉特異性表達外源基因轉基因小鼠的制備與鑒定
            2.8.1 轉基因小鼠的制備
            2.8.2 陽性鼠的PCR鑒定
        2.9 嵌合啟動子構建
            2.9.1 豬CKM增強子的獲得
            2.9.1 豬Enhancer-Promoter嵌合啟動子的構建
        2.10 豬α1-AT基因啟動子的克隆及重組表達質粒的構建
            2.10.1 豬α1-AT調控序列的獲得
            2.10.2 pGL3-Basic重組表達質粒的構建
        2.11 α1-AT啟動子與BGL1重組質粒的構建
            2.11.1 α1-AT基因信號肽的克隆
            2.11.2 BGL1基因CDS區(qū)域的克隆
            2.11.3 pGL3-AT-Signal-BGL1重組質粒的構建
        2.12 BGL1基因在Hepa1-6細胞中表達量的測定
            2.12.1 定量PCR分析BGL1在Hepa1-6細胞中的表達量
            2.12.2 Western Blot檢測BGL1蛋白質的表達量
第三章 結果與分析
    第一部分
        1 豬MyoG調控序列功能分析
            1.1 豬MyoG調控區(qū)域的生物信息學分析
                1.1.1 豬MyoG調控區(qū)域的結構預測
            1.2 豬MyoG啟動子克隆及重組質粒的構建
            1.3 C2C12細胞的誘導分化
            1.4 pGL3-MyoG-Basic質粒的雙熒光素酶活性檢測
            1.5 轉錄因子MyoD對MyoG啟動子的調控作用
                1.5.1 轉錄因子MyoD真核表達載體與啟動子片段共轉染
                1.5.2 轉錄因子MyoD真核表達載體與MyoG突變載體共轉染
                1.5.3 EMSA驗證MyoD結合位點的存在
        2 PPARγ表達載體的構建及其表達量測定
            2.1 PPARγ表達載體的構建
            2.2 QPCR檢測PPARγ在C2C12細胞中的表達量
            2.3 Western Blot檢測PPARγ蛋白質在C2C12細胞中的表達量
            2.4 轉基因小鼠的獲得
                2.4.1 轉基因小鼠PCR檢測
        3 豬CKM增強子活性的驗證
            3.1 含有Enhancer-Promoter載體的構建
    第二部分
        1 豬α1-AT基因調控序列功能分析
            1.1 豬α1-AT調控區(qū)域的生物信息學分析
            1.2 豬α1-AT啟動子克隆及缺失重組質粒的構建
            1.3 α1-AT缺失重組質粒的雙熒光素酶活性檢測
        2 BGL1基因表達載體的構建及其表達量測定
            2.1 BGL1表達載體的構建
            2.2 QPCR檢測BGL1在Hepa1-6細胞中的表達量
            2.3 Western Blot檢測蛋白質BGL1在Hepa1-6細胞中的表達量
第四章 討論
    1 啟動子的組織特異性研究
    2 啟動子分析
        2.1 豬MyoG啟動子的活性分析
        2.2 轉錄因子MyoD對啟動子活性的影響
        2.3 α1-AT啟動子的活性分析
    3 豬CKM增強子功能分析
    4 異位表達PPARγ對骨骼肌的影響
    5 肝臟特異性表達BGL1基因的意義
第五章 小結
    1 本研究取得的成果
    2 下一步工作計劃
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3022750