啟動(dòng)子是控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控片段。組織特異性啟動(dòng)子是在特定組織和器官中特異性表達(dá)基因的啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子在遺傳育種及性狀改良等應(yīng)用方面顯示出極高的價(jià)值。本試驗(yàn)采用豬肌肉特異性基因MyoG的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的過氧化物酶體增殖物激活受體基因在肌肉中異位表達(dá);采用豬肝臟特異性基因α1-AT啟動(dòng)子以及α1-AT基因的信號(hào)肽驅(qū)動(dòng)來源于扣囊復(fù)膜酵母的β-葡萄糖苷酶基因在肝臟中異位表達(dá)。為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型提供一定的理論基礎(chǔ)。取得的主要研究成果如下:1.采用在線軟件MEME比對(duì)豬、人和小鼠相同區(qū)域序列,確定豬MyoG啟動(dòng)子的功能區(qū)域位于第一外顯子5端附近�？寺∝iMyoG基因5’側(cè)翼806bp序列,TESS和TFSEARCH等分析該片段含有啟動(dòng)子的特征元件TATA box和多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn),如Sp1、E-box、C/EBP、NF-1、Myogenin等。構(gòu)建含有MyoG啟動(dòng)子的pGL3-MyoG報(bào)告質(zhì)粒,分別轉(zhuǎn)染分化Od、2d、3d、4d、6d的C2C12細(xì)胞和3T3-L1細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)MyoG啟動(dòng)子活性在C2C12細(xì)胞分化3天時(shí)達(dá)到最大,隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng),其活性逐漸降低;在3T3-... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 引言
    2 啟動(dòng)子簡(jiǎn)介
        2.1 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)
        2.2 啟動(dòng)子的研究方法
            2.2.1 基于生物信息學(xué)的啟動(dòng)子分析
            2.2.2 啟動(dòng)子克隆方法
            2.2.3 研究啟動(dòng)子功能的實(shí)驗(yàn)方法
        2.3 啟動(dòng)子的應(yīng)用
            2.3.1 應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
            2.3.2 應(yīng)用于RNA干擾
            2.3.3 臨床治療中的應(yīng)用
    3 MyoG/α1-AT啟動(dòng)子及CKM增強(qiáng)子研究進(jìn)展
        3.1 MyoG啟動(dòng)子研究進(jìn)展
        3.2 α1-AT啟動(dòng)子研究進(jìn)展
        3.3 CKM增強(qiáng)子研究現(xiàn)狀
    4 PPARγ的概述
    5 BGL1研究現(xiàn)狀
    6 研究目的和意義
第二章 材料與方法
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 DNA樣品
        1.2 載體和菌株
        1.3 試劑及其配置
            1.3.1 主要試劑
            1.3.2 試劑的配置
        1.4 主要數(shù)據(jù)庫及分析軟件
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 豬MyoG基因啟動(dòng)子的克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.1.1 豬基因組提取DNA及質(zhì)量鑒定
            2.1.2 豬MyoG調(diào)控序列的獲得
            2.1.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和回收
                2.1.3.1 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)
                2.1.3.2 PCR產(chǎn)物的回收及純化
            2.1.4 克隆載體的構(gòu)建及酶切回收
                2.1.4.1 PCR產(chǎn)物連接pMD18-T
                2.1.4.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
                2.1.4.3 陽性克隆的檢測(cè)及測(cè)序
                2.1.4.4 連接pMD18-T質(zhì)粒小量提取
            2.1.5 pGL3-MyoG重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.1.5.1 pMD18-T及pGL3-Basic載體雙酶切及回收
                2.1.5.2 pGL3-Basic重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.1.5.3 重組質(zhì)粒的去內(nèi)毒素小量提取及雙酶切鑒定
        2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
            2.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇
            2.2.2 細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)
            2.2.3 細(xì)胞凍存
            2.2.4 C2C12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
        2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性的測(cè)定
            2.3.1 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
            2.3.2 雙熒光素酶相對(duì)活性的檢測(cè)
                2.3.2.1 細(xì)胞裂解
                2.3.2.2 雙熒光素酶活性的檢測(cè)及計(jì)算
            2.3.3 數(shù)據(jù)的處理及分析
        2.4 真核表達(dá)載體以及MyoG突變載體構(gòu)建
            2.4.1 轉(zhuǎn)錄因子MyoD真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定
            2.4.2 pcDNA3.1-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.4.3 MyoG突變載體的構(gòu)建
        2.5 EMSA驗(yàn)證MyoD結(jié)合位點(diǎn)的存在
            2.5.1 制備探針
            2.5.2 核蛋白提取
            2.5.3 凝膠遷移試驗(yàn)
        2.6 MyoG啟動(dòng)子與PPARy重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.6.1 豬PPARγ基因CDS區(qū)域的克隆
            2.6.2 PPARγ與pGL3-MyoG重組質(zhì)粒的鑒定
        2.7 PPARγ基因在C2C12細(xì)胞中表達(dá)量的測(cè)定
            2.7.1 小鼠C2C12細(xì)胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
            2.7.2 定量PCR分析PPARγ在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)量
            2.7.3 C2C12細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取
            2.7.4 Western Blot檢測(cè)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)量
                2.7.4.1 SDS-PAGE電泳
                2.7.4.2 轉(zhuǎn)膜
                2.7.4.3 抗原抗體免疫反應(yīng)
        2.8 肌肉特異性表達(dá)外源基因轉(zhuǎn)基因小鼠的制備與鑒定
            2.8.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
            2.8.2 陽性鼠的PCR鑒定
        2.9 嵌合啟動(dòng)子構(gòu)建
            2.9.1 豬CKM增強(qiáng)子的獲得
            2.9.1 豬Enhancer-Promoter嵌合啟動(dòng)子的構(gòu)建
        2.10 豬α1-AT基因啟動(dòng)子的克隆及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.10.1 豬α1-AT調(diào)控序列的獲得
            2.10.2 pGL3-Basic重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.11 α1-AT啟動(dòng)子與BGL1重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.11.1 α1-AT基因信號(hào)肽的克隆
            2.11.2 BGL1基因CDS區(qū)域的克隆
            2.11.3 pGL3-AT-Signal-BGL1重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.12 BGL1基因在Hepa1-6細(xì)胞中表達(dá)量的測(cè)定
            2.12.1 定量PCR分析BGL1在Hepa1-6細(xì)胞中的表達(dá)量
            2.12.2 Western Blot檢測(cè)BGL1蛋白質(zhì)的表達(dá)量
第三章 結(jié)果與分析
    第一部分
        1 豬MyoG調(diào)控序列功能分析
            1.1 豬MyoG調(diào)控區(qū)域的生物信息學(xué)分析
                1.1.1 豬MyoG調(diào)控區(qū)域的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
            1.2 豬MyoG啟動(dòng)子克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            1.3 C2C12細(xì)胞的誘導(dǎo)分化
            1.4 pGL3-MyoG-Basic質(zhì)粒的雙熒光素酶活性檢測(cè)
            1.5 轉(zhuǎn)錄因子MyoD對(duì)MyoG啟動(dòng)子的調(diào)控作用
                1.5.1 轉(zhuǎn)錄因子MyoD真核表達(dá)載體與啟動(dòng)子片段共轉(zhuǎn)染
                1.5.2 轉(zhuǎn)錄因子MyoD真核表達(dá)載體與MyoG突變載體共轉(zhuǎn)染
                1.5.3 EMSA驗(yàn)證MyoD結(jié)合位點(diǎn)的存在
        2 PPARγ表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)量測(cè)定
            2.1 PPARγ表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2 QPCR檢測(cè)PPARγ在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)量
            2.3 Western Blot檢測(cè)PPARγ蛋白質(zhì)在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)量
            2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得
                2.4.1 轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測(cè)
        3 豬CKM增強(qiáng)子活性的驗(yàn)證
            3.1 含有Enhancer-Promoter載體的構(gòu)建
    第二部分
        1 豬α1-AT基因調(diào)控序列功能分析
            1.1 豬α1-AT調(diào)控區(qū)域的生物信息學(xué)分析
            1.2 豬α1-AT啟動(dòng)子克隆及缺失重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            1.3 α1-AT缺失重組質(zhì)粒的雙熒光素酶活性檢測(cè)
        2 BGL1基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)量測(cè)定
            2.1 BGL1表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2 QPCR檢測(cè)BGL1在Hepa1-6細(xì)胞中的表達(dá)量
            2.3 Western Blot檢測(cè)蛋白質(zhì)BGL1在Hepa1-6細(xì)胞中的表達(dá)量
第四章 討論
    1 啟動(dòng)子的組織特異性研究
    2 啟動(dòng)子分析
        2.1 豬MyoG啟動(dòng)子的活性分析
        2.2 轉(zhuǎn)錄因子MyoD對(duì)啟動(dòng)子活性的影響
        2.3 α1-AT啟動(dòng)子的活性分析
    3 豬CKM增強(qiáng)子功能分析
    4 異位表達(dá)PPARγ對(duì)骨骼肌的影響
    5 肝臟特異性表達(dá)BGL1基因的意義
第五章 小結(jié)
    1 本研究取得的成果
    2 下一步工作計(jì)劃
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]成肌細(xì)胞成脂過程中PPARγ、C/EBPα和Myogenin基因啟動(dòng)子的甲基化變化[J]. 姜美華,巨婷婷,劉洋,許玲,孫文娟,趙泮峰,尹靖東.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2013(14)
[2]攜帶不同數(shù)量增強(qiáng)子的嵌合型肝臟特異性啟動(dòng)子的構(gòu)建及其體外實(shí)驗(yàn)研究[J]. 李文博,張偉峰,陳胤伯,王東陽,張琛,夏海濱.  中國(guó)生物工程雜志. 2012(01)
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本文編號(hào)：3022750