發(fā)布時間：2021-02-03 10:45

　　TALENs技術(shù)是最近幾年來迅速發(fā)展起來的基因靶向修飾技術(shù),該技術(shù)能夠簡單、高效的在目標(biāo)靶基因位點處產(chǎn)生多種突變效應(yīng),現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于各種動植物細(xì)胞及個體的基因修飾研究中。與經(jīng)典的基因打靶技術(shù)相比,TALEN核酸酶在與基因打靶載體的共同作用下,具有“一步法”完成目標(biāo)基因的敲除和外源基因定點敲入的優(yōu)勢。本研究通過利用TALENs基因編輯技術(shù)和hLF基因打靶載體在山羊BLG基因第一外顯子起始密碼子附近敲除目標(biāo)靶序列,并在敲除位點引入人乳鐵蛋白基因,從而降低山羊乳汁中對人具有致敏作用的p-乳球蛋白的含量,提高羊奶的營養(yǎng)和消費價值。本研究的目的是應(yīng)用TALENs技術(shù)與山羊β-乳球蛋白調(diào)控序列,PCR擴增獲得的hLF cDNA基因序列,人巨細(xì)胞病毒啟動／增強子（Pcmv）和SV40 poly A以及HSV-TK的負(fù)篩選基因等元件,構(gòu)建含新霉素抗性篩選基因（Neo）的乳腺特異性表達(dá)hLF的基因打靶載體。用構(gòu)建獲得的TALENs和乳腺特異性打靶載體轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞,篩選獲得轉(zhuǎn)基因單克隆細(xì)胞株,并通過體細(xì)胞核移植技術(shù)制備在BLG基因上定點敲入hLF的轉(zhuǎn)基因山羊。移植受體并通過懷孕出生的轉(zhuǎn)基因山羊... 

【文章來源】：揚州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
符號說明
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1. 動物基因打靶的研究進(jìn)展
        1.1 動物基因打靶的簡介
        1.2 動物基因打靶技術(shù)的應(yīng)用和前景
        1.3 基因打靶的新技術(shù)
        1.4 動物基因打靶中存在的障礙和優(yōu)化措施
    2. TALENs基因定點修飾技術(shù)研究進(jìn)展
        2.1 TALENs基因修飾技術(shù)簡介
        2.2 TALENs的基本結(jié)構(gòu)與技術(shù)原理
        2.3 TALENs的設(shè)計與構(gòu)建
        2.4 TALENs的應(yīng)用和展望
    3. 人乳鐵蛋白的研究進(jìn)展
        3.1 人乳鐵蛋白的基因及其蛋白
        3.2 人乳鐵蛋白的主要生理作用
        3.3 轉(zhuǎn)基因動物乳腺特異性表達(dá)重組hLF的研究進(jìn)展
第二章 山羊BLG基因TALENs的設(shè)計與構(gòu)建
    1. 實驗材料
        1.1 主要試劑
        1.2 試驗儀器及器材
        1.3 主要試劑的配制
    2. 實驗方法
        2.1 BLG基因的檢索
        2.2 TALENs的設(shè)計
        2.3 TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
    3. 結(jié)果
第三章 乳腺特異性表達(dá)hLF基因打靶載體的構(gòu)建
    1. 試驗材料
        1.1 菌種及質(zhì)粒
        1.2 試驗儀器
        1.3 分子生物學(xué)試劑
        1.4 主要試劑的配制
    2. 實驗方法
        2.1 PCR引物合成和測序
        2.2 常規(guī)分子生物學(xué)的操作方法
        2.3 質(zhì)粒酶切反應(yīng)
        2.4 酶切產(chǎn)物的回收
        2.5 連接反應(yīng)
    3. 乳腺特異性打靶載體的構(gòu)建
        3.1 PCR擴增BLG5’、BLG3’調(diào)控序列和乳腺特異性表達(dá)載體功能區(qū)
        3.2 山羊BLG5’調(diào)控序列和乳腺特異性表達(dá)載體功能區(qū)相連
        3.3 山羊BLG3’調(diào)控序列和表達(dá)載體BF相連
        3.4 含單個負(fù)篩選HSV-TK基因與乳腺特異性表達(dá)載體BFN-7相連
    4. 結(jié)果
        4.1 山羊BLG5’和BLG3’調(diào)控序列的擴增
        4.2 PCR擴增乳腺特異性表達(dá)載體功能區(qū)
        4.3 乳腺特異性表達(dá)hLF基因打靶載體的構(gòu)建
第四章 基因打靶細(xì)胞系和基因打靶山羊的制備
    1. 試驗材料
        1.1 試驗儀器
        1.2 試驗器械
        1.3 主要試劑
        1.4 試驗動物
    2. 試驗方法
        2.1 胎兒成纖維細(xì)胞的準(zhǔn)備
        2.2 打靶載體與TALENs轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞
        2.3 細(xì)胞株P(guān)CR檢測
        2.4 體細(xì)胞核移植制作基因打靶山羊胎兒
    3. 結(jié)果
        3.1 抗性細(xì)胞株的整合檢測
        3.2 轉(zhuǎn)染基因打靶載體細(xì)胞統(tǒng)計結(jié)果
    4. 討論
第五章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用啟動子缺陷型打靶載體敲除五指山小型豬GGTA1基因[J]. 鄭道山,馮沖,朱彥賓,龍川,馮書堂,潘登科,馬文麗.  生物技術(shù)通訊. 2011(04)
[2]Myostatin基因打靶載體的構(gòu)建及豬胎兒成纖維細(xì)胞Myostatin基因的敲除[J]. 李鴻輝,馮沖,王寧,閆軍,哈福,陳紅星,樊寶良,潘登科.  生物技術(shù)通訊. 2010(05)
[3]基因打靶定點突變秦川牛MSTN基因[J]. 劉永剛,華松,蘭杰,宋永利,何玉龍,權(quán)富生,張涌.  生物工程學(xué)報. 2010(03)
[4]利用多重篩選機制提高山羊乳腺上皮細(xì)胞基因打靶的效率[J]. 沈偉,閔令江,李蘭,潘慶杰,吳曉潔,周艷榮,鄧?yán)^先.  遺傳學(xué)報. 2005(04)
[5]體細(xì)胞基因打靶制備動物乳腺生物反應(yīng)器的策略與應(yīng)用[J]. 沈偉,2.楊正田,鄧?yán)^先.  生物工程學(xué)報. 2003(06)

博士論文
[1]乳蛋白與CMV復(fù)合啟動子驅(qū)動hLF cDNA乳腺特異性表達(dá)[D]. 成勇.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[2]小尾寒羊骨骼肌細(xì)胞Myostatin基因打靶的研究[D]. 張蕾.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005

碩士論文
[1]hLF基因打靶山羊胎兒成纖維細(xì)胞株的建立及其整合位點的分析[D]. 孫麗新.華東師范大學(xué) 2004



本文編號：3016375