發(fā)布時(shí)間：2021-01-31 18:33

　　為研究豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）ORF7蛋白的亞細(xì)胞定位及其在TGEV復(fù)制中的作用。本研究通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增TGEV ORF7基因,將其與真核表達(dá)載體pEGFP-C1和pEGFP-N1相連接,構(gòu)建表達(dá)載體pGFP-ORF7（GFP融合在TGEV ORF7的-NH2端）和pORF7-GFP（GFP融合在ORF7的-COOH端）。分別將這兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至ST細(xì)胞,western blot檢測(cè)融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP的表達(dá)。通過(guò)生物信息學(xué)分析和激光共聚焦確定TGEV ORF7蛋白的亞細(xì)胞定位。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)細(xì)胞病變觀察和熒光定量PCR檢測(cè)TGEV ORF7蛋白對(duì)TGEV復(fù)制的影響。結(jié)果顯示,本研究正確構(gòu)建了真核表達(dá)載體pGFP-ORF7和pORF7-GFP,western blot檢測(cè)結(jié)果表明融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP均正確表達(dá),TGEV ORF7蛋白大小約為9 ku;結(jié)合生物信息學(xué)分析和激光共聚焦共定位結(jié)果顯示TGEV ORF7特異性的定位于ST細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,其定位和其N(xiāo)端的信號(hào)肽序列有關(guān);熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)ORF7蛋白后TGEV ... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2020,42(06)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：6 頁(yè)

【部分圖文】：

TGEV ORF7基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

將各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ST細(xì)胞24 h后的觀察結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pGFP-ORF7、pORF7-GFP和空載體pEGFP-C1的細(xì)胞中均能觀察到綠色熒光。表明標(biāo)簽蛋白GFP無(wú)論融合在TGEV ORF7的-NH2端和-COOH端，融合蛋白均可以表達(dá)。同時(shí)，western blot的鑒定結(jié)果顯示，融合蛋白GFP-ORF7和ORF7-GFP分子質(zhì)量均約為35 ku,GFP蛋白的分子質(zhì)量為27 ku，據(jù)此推算TGEV ORF7蛋白的分子質(zhì)量約為9 ku（圖2）。上述結(jié)果表明TGEV ORF7蛋白在ST細(xì)胞中均得到正確表達(dá)。2.3 TGEV ORF7蛋白信號(hào)肽的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)生物信息學(xué)軟件（http://ipsort.hgc.jp/predict.cgi），對(duì)TGEV ORF7蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，肽段序列分析閾值為0.953，評(píng)分高于0.953及以上的序列成為信號(hào)肽的可能性大。TGEV ORF7蛋白分析結(jié)果顯示，其N(xiāo)端的第1～30個(gè)氨基酸（MLV-FL HAVFI TVLIL LLIGR LQLLE RLLLN）的信號(hào)肽序列區(qū)域預(yù)測(cè)值為2.1933，即圖中紅色肽段區(qū)域，遠(yuǎn)高于信號(hào)肽預(yù)測(cè)的閾值（圖3）。初步表明TGEV ORF7蛋白的N端1～30個(gè)氨基酸具有信號(hào)肽序列特征。2.4 TGEV ORF7蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]2014年～2016年山東省部分地區(qū)豬傳染性胃腸炎流行病學(xué)調(diào)查[J]. 孫秋艷,孫霞,王志遠(yuǎn),袁東芳.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(03)
[2]豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的C和D線性抗原表位的抗原性比較[J]. 于天飛,張喜文,朱可佳,陳剛,李赫,陸澤,謝鵬宇.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(11)
[3]抗豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白單克隆抗體的制備及抗原表位的鑒定[J]. 趙鑫,張?chǎng)?時(shí)紅艷,陳建飛,遲延彬,韓斆,李長(zhǎng)龍,劉寧,胡桂學(xué),馮力.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(04)



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