豬傳染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP）,是由豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的一種豬的傳染性呼吸道疾病,是造成世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的一個(gè)主要問(wèn)題。臨床上,該病以肺部有出血性,纖維素性滲出和壞死性損害為主要診斷特征,隨著耐藥菌株的出現(xiàn)而變得日趨難以應(yīng)對(duì)。盡管目前很多與APP致病有關(guān)的毒力因子已被報(bào)道,但由于其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜,它們?cè)贏PP的整個(gè)感染和致病過(guò)程中究竟起著怎么樣的作用,目前仍不完全清楚。雙組份調(diào)控系統(tǒng)（Two-Component Regulatory System,TCS）是細(xì)菌感應(yīng)外界環(huán)境變化最普遍的信號(hào)傳遞裝置,通過(guò)感知外界環(huán)境信號(hào)變化并做出應(yīng)答從而適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境的變化。此外,在病原菌的感染過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,如調(diào)節(jié)細(xì)菌生長(zhǎng)代謝、耐藥性、毒力表達(dá)等。對(duì)已完成測(cè)序的APP血清3型JL03全基因組序列分析發(fā)現(xiàn),在APP中共有五對(duì)雙組份,分別是ArcA/ArcB, CpxA/CpxR, NarP/NarQ, PhoB/PhoR, QseB/QseC。... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞（Abbreviation）
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 胸膜肺炎放線桿菌概述
        1.1.1 病原學(xué)
        1.1.2 流行病學(xué)
        1.1.3 豬傳染性胸膜肺炎的致病機(jī)理
        1.1.4 胸膜肺炎放線桿菌毒力因子研究進(jìn)展
    1.2 雙組份調(diào)控系統(tǒng)
        1.2.1 雙組份調(diào)控系統(tǒng)概述
        1.2.2 胸膜肺炎放線桿菌TCS研究現(xiàn)狀
        1.2.3 CpxA/R雙組份調(diào)控系統(tǒng)研究現(xiàn)狀
第二章 研究目的與意義
第三章 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)條件
        3.1.2 各種酶類和試劑
        3.1.3 培養(yǎng)基以及抗生素的配制
        3.1.4 主要溶液的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 胸膜肺炎放線桿菌基因組的提取
        3.2.2 PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物的回收與純化
        3.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.4 質(zhì)粒的小量制備
        3.2.5 質(zhì)粒的大量制備（堿裂解法）
        3.2.6 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（氯化鈣法）
        3.2.7 胸膜肺炎放線桿菌電轉(zhuǎn)化
        3.2.8 Southern blotting
        3.2.9 RNA的抽提
        3.2.10 SLW01菌株中CpxA、CpxR基因上下游同源臂的擴(kuò)增與鑒定
        3.2.11 重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEM-CpxA/R的構(gòu)建
        3.2.12 突變株△CpxA/R的構(gòu)建
        3.2.13 △CpxA/R互補(bǔ)菌株C△CpxA/R的構(gòu)建與鑒定
        3.2.14 雙基因缺失突變株△CpxA/R與互補(bǔ)菌株C△CpxA/R的生物學(xué)特性分析
        3.2.15 實(shí)時(shí)熒光定量差異基因的篩選
        3.2.16 反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白CpxR的表達(dá)純化
        3.2.17 SDS-PAGE蛋白凝膠電泳
第四章 結(jié)果與分析
    4.1 雙組份調(diào)控系統(tǒng)CPXA/R基因結(jié)構(gòu)分析
    4.2 CPXAR雙基因上下游同源臂的擴(kuò)增
    4.3 重組轉(zhuǎn)移自殺性質(zhì)粒PEM-CPXA/R的構(gòu)建與鑒定
    4.4 雙基因缺失突變株△CPXA/R的篩選和PCR鑒定
    4.5 △CPXA/R雙基因缺失突變株的測(cè)序鑒定和SOUTHERN BLOT鑒定
        4.5.1 測(cè)序鑒定
        4.5.2 △CpxA/R雙基因缺失突變株的Southern blot鑒定
    4.6 雙基因缺失突變株△CPXA/R的遺傳穩(wěn)定性分析
    4.7 △CPXA/R互補(bǔ)菌株CACPXA/R的構(gòu)建與鑒定
    4.8 雙基因缺失突變株△CPXA/R的生長(zhǎng)特性分析
    4.9 雙基因缺失突變株△CPXA/R的溶血活性分析
    4.10 雙基因缺失突變株△CPXA/R的小鼠致病力分析
    4.11 細(xì)菌透射電鏡
    4.12 細(xì)胞吞噬試驗(yàn)
    4.13 細(xì)胞黏附試驗(yàn)
    4.14 細(xì)胞侵入試驗(yàn)
    4.15 熒光定量PCR
    4.16 反應(yīng)調(diào)控蛋白CPXR的表達(dá)
第五章 討論
    5.1 兩步單交換法構(gòu)建缺失突變株
    5.2 APP中CPXA/R雙組份調(diào)控系統(tǒng)可能的功能
    5.3 后續(xù)展望
第六章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附表：11個(gè)被篩選基因QRT-PCR差異表達(dá)情況


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬傳染性胸膜肺炎的診斷與防治[J]. 蔡寶祥.  遼寧畜牧獸醫(yī). 1996(03)
[2]我國(guó)豬胸膜肺炎嗜血桿菌感染癥的確定和診斷[J]. 楊旭夫,彭發(fā)泉.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 1990(03)

博士論文
[1]胸膜肺炎放線桿菌毒素ApxIV的致病性及基因缺失弱毒疫苗的研究[D]. 劉金林.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[2]胸膜肺炎放線桿菌和豬瘟病毒的基因組測(cè)序與比較基因組學(xué)研究[D]. 徐卓菲.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008
[3]胸膜肺炎放線桿菌△apxIC/△apxIIC雙基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性和免疫原性的研究[D]. 林荔雯.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007
[4]豬胸膜肺炎放線桿菌apxⅡ基因工程突變株構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究[D]. 貝為成.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2005

碩士論文
[1]胸膜肺炎放線桿菌雙組份調(diào)控系統(tǒng)QseB/QseC突變株構(gòu)建功能研究[D]. 胡琳琳.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[2]豬胸膜肺炎放線桿菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)ΔnarQ/narP突變株構(gòu)建及功能研究[D]. 劉源.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3005505